滇池金线鲃（Sinocyclocheilus grahami）耳石的茜素红及茜素络合物标志

赵亚鹏, 潘晓赋, 杨君兴,*, 陈小勇,*, 王晓爱, 李再云

1. 中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室，云南 昆明 650223

2. 中国科学院大学，北京 100049

滇池金线鲃（Sinocyclocheilus grahami）隶属鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）金线鲃属（Sinocyclocheilus），分布于滇池流域，为国家二级保护动物，同时，已被列入《中国濒危动物红皮书（鱼类）》（Yue et al，1998）。自上世纪80年代起，由于环境污染、栖息地破坏及滥捕滥捞等原因，滇池金线鲃数量急剧下降（Chen et al，2001）。目前，滇池金线鲃的人工繁殖已经成功（Yang et al，2007），并于2009年开始实施人工增殖放流，且放流规格通常不超过5 cm。一些常规标志方法，如穿刺标记（percutaneous tags）、可视性植入标记（visible implant tags）及线码标记（coded wire tags）等易对放流规格滇池金线鲃造成伤害且成本较高。利用能与钙结合的化学染料溶液浸泡早期鱼苗，从而在耳石上形成相应标志环的耳石标记法，能够一次性标记大量早期鱼苗，操作简单，对鱼体损伤小，且标记形成后，不会被代谢吸收，理论上能保留终身（van der Walt & Faragher，2003），已被应用于香鱼（Plecoglossus altivelis）人工增殖放流（Tsukamoto，1988）及珊瑚鱼类的种群生态学研究（Jones et al，1999）。常用化学染料有：茜素络合物（alizarin complexone，ALC）、茜素红（alizarin red S，ARS）及盐酸四环素（oxytetracycline，OTC）等，由于对化学染料的耐受性和敏感性不同（Fu et al，2005；Jin et al，2011；Tsukamoto，1988），不同鱼种的最佳浸泡条件也不相同。本研究旨在寻找浸泡标记滇池金线仔稚鱼的最佳条件，为其早期鱼苗的大规模标记提供技术支持，并为放流后的评估工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源及管理

6日龄（60尾）、20日龄（60尾）及90日龄（80尾）健康滇池金线鲃鱼苗均来自中国科学院昆明动物研究所珍稀鱼类保育研究基地。亲本系2005年5～7月采自滇池流域的嵩明县牧羊河。 6日龄组鱼苗投喂蛋黄浆及黄豆浆，20日龄组鱼苗投喂轮虫，90日龄鱼苗投喂破碎的111鲤鱼饲料（颗粒直径≤0.5 mm，通威股份有限公司昆明分公司）（Pan et al，2009）。

1.2 浸泡溶液配置

实验采用分析纯茜素络合指示剂（上海冠翔生物技术有限公司，3952-78-1）及茜素红（上海冠翔生物技术有限公司，130-22-3）。为提高溶解度，先由蒸馏水配置成为500 mg/L的母液，然后用曝气地下水稀释至所需浓度。

1.3 实验方案

两种化学染料的浸泡液浓度、浸泡时间及样本大小见表1，表2，各试验组样本数为10尾。实验期间将样本置于温度为16～18 ℃的房间，浸泡实验开始前 24 h不投饵，浸泡结束更换清水后恢复投饵，暂养一段时间后用丁香油麻醉致死后摘取耳石并观察。

1.4 耳石摘取及观察

将样本鱼体置于双筒解剖镜下，以解剖针将耳石取出，置于玻片上，清水和酒精清洗及二甲苯透明后，由透明指甲油封存。由于星耳石在仔鱼出膜后～30 d出现，矢耳石在出膜30 d后开始呈现狭长生长，90 d后在剥取时易破碎，故两者均不宜作为标记检测载体，而应以微耳石作为检测对象。光学显微镜和荧光显微镜（选择510～560 nm绿色激光作为激发光）观察标记效果（Fu et al，2005），且标记效果分为无、可见、清晰及强烈四个等级。

2 结果

2.1 浸泡液安全浓度

茜素红溶液浓度对仔稚鱼的影响结果显示（表1），浓度50～150 mg/L，浸泡4～36 h条件下，除50 mg/L，4 h实验组中因操作不当造成1尾死亡外，其他各组均存活率均为100%。当浓度至200 mg/L时，90日龄稚鱼出现死亡，24 h和36 h组死亡率分别为30%（n=10）和20%（n=10）。

表1 茜素红溶液浸泡标记方案及标记效果Table 1 Details of immersion experiments using ARS and their subsequent marking results

茜素络合物溶液浸泡标记结果显示（表2），浓度50～100 mg/L，浸泡4～8 h，6日龄仔鱼成活率为100%（n=10），当浓度达到150 mg/L时，仔鱼开始死亡，浸泡8 h，死亡率达30%（n=10）。为实验对象时，浓度50～150 mg/L，浸泡12～24 h，对20及90日龄仔稚鱼的生存没有影响，且在该浓度下，浸泡时间延长至3 d，鱼苗仍能存活。当浓度＞200 mg/L时，90日龄稚鱼全部死亡。

表2 茜素络合物溶液标记方案及标记效果Table 2 Details of immersion experiments using ALC and their subsequent marking results

2.2 标记效果

2.2.1 茜素红浸泡效果

可见光下，普通光学显微镜观察茜素红溶液浸泡标记的滇池金线鲃耳石，可见紫红色标记环带，且标记强度与个体日龄、浸泡浓度及浸泡时间有关。6日龄仔鱼，50 mg/L、4 h实验组可观察到可辨识微弱标记环，100及150 mg/L试验组均能形成清晰标记环。20日龄仔鱼，50 mg/L、12 h试验组未见标记环，50 mg/L、2 h及100 mg/L，12 h实验组仅见微弱标记环，150 mg/L、24 h试验组标志环颜色最为强烈（图A，B）。90日龄稚鱼，50 mg/L未见标志环，100～200 mg/L可见标记环。荧光显微镜（绿色激发光）观察，各实验组均可见猩红色荧光反应，且标记个体日龄越小、浸泡浓度越大及浸泡时间越长，其颜色越强烈。

图1 茜素红各类标记方案对仔鱼微耳石的标记效果Figure 1 Marking results of immersion experiments using ARS

图2 茜素络合物对仔鱼微耳石的标记效果Figure 1 Marking results of immersion using ALC

2.2.2 茜素络合物浸泡效果

可见光下，普通光学显微镜观察结果显示，茜素络合物溶液浸泡标记的仔稚鱼耳石呈现与茜素红相同的紫红色标记环，且相对于茜素红，滇池金线鲃仔稚鱼对茜素络合物溶液更加敏感。6日龄仔鱼，50 mg/L，4 h实验组可见清晰标记环。20日龄和90日龄鱼苗，50～150 mg/L实验组均可见紫红色标记环。荧光显微镜下（510～560 nm绿色激发光），各实验组标记带均呈猩红色银光荧光反应。

3 讨论

3.1 检测条件

可见光及绿色激光下均能观察到茜素红和茜素络合物在耳石上所形成的标记环。绿色激光下，标记环内部区域呈猩红色，与浸泡标记后生长的耳石部分形成强烈对比，可见光下，仅能观察到深红色的标记环；绿色激光下，不能观察到耳石的生长轮，可见光下，可观察到标记环前后形成的生长轮；形成可见光下可被观察到的标记环所需的浸泡强度高于绿色激光。因此，可见光检测的方法更适用于耳石生长轮生长规律的研究，而绿色激光检测方法更适用于放流标记。

3.2 浸泡条件及化学染料

浸泡浓度和浸泡时间均可影响标记效果。相同浸泡浓度下，浸泡时间越长，效果越好，同时，为提高标记效率，浸泡时间不宜过长。6日龄仔鱼，浸泡时间以8 h为宜，20 和90日龄鱼苗浸泡时间以24 h为宜。在安全浓度范围内，浸泡液浓度越高，标记效果越好。为使在可见光下标记效果达到清晰易于辨认的级别，标记6日龄仔鱼时，茜素红和茜素络合物的浸泡液浓度需达到50 mg/L；标记20日龄仔鱼时，两种浸泡液浓度要分别达到 100 mg/L和50 mg/L；标记90日龄稚鱼时，浓度要分别达到150 mg/L和100 mg/L。而在绿色激光下，50 mg/L的茜素红和茜素络合物溶液浸泡6、20及90日龄鱼苗，便可见清晰标记，且以上浸泡条件均不影响仔鱼生存。若以放流标记为目的，50 mg/L为茜素红和茜素络合物溶液的合适浓度，而不超过20日龄的鱼苗，还可适当降低浸泡浓度。相同浓度下，茜素络合物标记效果优于茜素红，但茜素红更具价格优势，综合考虑茜素红为标记滇池金线鲃的最佳化学染料。

3.3 标记规格

Secor et al（1991）认为, 不同鱼龄个体之间标记效果的差异也许和代谢速率有关，低龄鱼代谢率高于高龄鱼，更易吸收化学染料并形成标记。滇池金线鲃标记试验中，个体越小，越易形成标记环。相同浸泡强度下，20日龄仔鱼耳石标记效果优于90日龄稚鱼。个体越小，浸泡标记期间的饲养密度就越大，6日龄仔鱼饲养密度远高于90日龄稚鱼，大大提高了荧光染料的利用率。因此，从标记效果、浸泡效率及荧光染料利用率等方面来看，相较 20及90日龄仔稚鱼，6日龄仔鱼更适宜于标记放流。

综上所述，茜素红和茜素络合物均适用于滇池金线鲃仔稚鱼耳石标记，但茜素红更具价格优势，更适用于大规模标记放流。浸泡标记时，标记环大小取决于浸泡时仔稚鱼耳石的大小，通过标记不同日龄仔稚鱼来控制标记环的大小，从而区分不同的放流群体，是今后的研究重点之一。

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