苦瓜籽蛋白的提取条件及其抗氧化性质

张 美 萍，叶 淑 红，王 际 辉，王 晗，肖 珊，金 慧 燕

(大连工业大学 辽宁省食品生物技术重点实验室，辽宁 大连 116034)

0 引 言

苦瓜具有提高人体免疫力等良好的食用和药用价值[1]，但苦瓜籽目前还未能引起人们的关注和重视，常常作为废物弃掉。近期的研究表明，苦瓜籽中同样含有丰富的活性成分[1]。苦瓜籽蛋白可以特异性地抑制一些肿瘤细胞，诱发其凋亡，但对正常的细胞却没有毒副作用，因此在临床领域的应用上有着广阔的前景[2]。

近年来，国内外许多学者从苦瓜籽中提取蛋白质并对其生理作用进行研究[3－4]，研究发现，苦瓜籽蛋白具有多方面的生物活性和功能，尤其在清除自由基方面。目前对于苦瓜籽蛋白的抗氧化活性主要是研究SOD(超氧化物歧化酶)的活性[5]，而清除羟自由基(·OH)的研究还未见报道。本试验优化了苦瓜籽蛋白的提取条件，并研究了苦瓜籽蛋白的还原力和清除羟自由基(·OH)的能力，为以后进一步的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

干苦瓜籽，山东寿光市场中购买。

考马斯亮蓝G－250(0.1mg／mL)：称取50mg G－250溶于25mL 95%乙醇中，加入50mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至500mL。标准牛血清蛋白液(1.0mg／mL)：称取100mg牛血清蛋白，用0.9%生理盐水配制，定容至100mL。铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、磷酸二氢钾、番红花红、ED－TA－Na2、硫酸亚铁、硼酸、甲基红、无水乙醇、溴甲酚绿等，分析纯；85%浓磷酸、丙酮等。

1.2 方 法

1.2.1 苦瓜籽粉的制备

将晒干的苦瓜籽去壳粉碎，过50目筛，得苦瓜籽粉，105℃恒重法[6]测定苦瓜籽中的水分。

1.2.2 苦瓜籽蛋白的提取

准确称取2.0g苦瓜籽粉，加入2mmol／L不同pH的磷酸缓冲液(PBS)20mL，于25℃、150r／min条件下搅拌一定时间后于10 000r／min离心15min，离心后取上清液，加入一定液料比的50%的丙酮溶液，摇匀。将混合溶液于4 000r／min离心10min，取沉淀，加入2mmol／L的磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.2)10mL溶解，得到的溶液为苦瓜籽蛋白的粗提液[7]。

1.2.3 成分测定方法

粗蛋白质量分数的测定采用凯氏定氮法[8]，提取液中蛋白质质量分数的测定采用考马斯亮蓝法[9]，粗脂肪质量分数的测定采用索氏提取法[10]。

1.2.4 单因素试验

分别以液料比、提取体系pH、搅拌时间为单因素，考察各因素对苦瓜籽蛋白提取率的影响。各因素水平梯度分别为：液料比1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1；提取体系pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0；搅拌时间 1、2、3、4、5h。将提取液中蛋白质和苦瓜籽总蛋白质量之比定义为蛋白质提取率(%)。

1.2.5 正交试验优化

在单因素试验基础上，进行三因素三水平试验，每个试验做3个平行，采用L9(33)试验。其因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平Tab.1 Factors and levels

1.2.6 苦瓜籽蛋白还原能力的测定

取不同浓度的苦瓜籽蛋白样品溶液1mL，加入0.2mol／L的pH 6.6磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.5mL，混匀，50℃水浴保温20min，冷却，加入2.5mL 10%的三氯乙酸终止反应。摇匀，离心，取上清液2.5mL，加入2.5mL去离子水和0.5mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀，静置10min，以去离子水作参比，700nm下测定吸光度值。以同浓度维生素C作阳性对照，吸光度值越大表示还原能力越强[12]。

1.2.7 苦瓜籽蛋白对羟自由基的清除

取0.15mol／L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液1.0mL、番红花红(0.52mg／mL)0.2mL、6mmol／L的 EDTA－Na2－Fe2＋1.0mL(现 配 现用)，再加入不同浓度的样品溶液3mL，最后加入0.3%的过氧化氢0.8mL，混匀后于37℃水浴中保温30min，在520nm处测定吸光值，空白组以等体积去离子水代替样品溶液，对照组以等体积去离子水代替样品溶液和过氧化氢溶液。以同浓度维生素C代替多糖作对比试验[13]。结果按下式计算：

式中：A0为空白组吸光度值；A1为苦瓜籽蛋白样品的吸光度值；A2为对照组吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 苦瓜籽粗蛋白的含量

用恒重法测得苦瓜籽粉含水分为4.0%。用凯氏定氮法测得的苦瓜籽蛋白质量分数为39.6%，与文献报道的39%～45%一致[14]。用索氏提取法测得苦瓜籽脂肪质量分数为38%。表明苦瓜籽具有很高的营养价值。

2.2 单因素试验

2.2.1 液料比的影响

由图1可知，苦瓜籽蛋白质提取率受液料(丙酮与样液)比的影响较明显，随着丙酮体积增大，苦瓜籽蛋白质提取率随之上升，当液料比为3.5∶1时达到最大值16.28%，液料比为4∶1时蛋白质提取率开始降低。可能是丙酮浓度太高导致蛋白质变性使可溶性蛋白溶解度降低，从而使蛋白质提取率降低，所以液料比选择3.5∶1为最佳。

图1 液料比对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of liquid－solid ratio on the protein extraction rate

2.2.2 提取体系pH的影响

由于蛋白质为两性电解质，所以提取体系的pH会影响苦瓜籽蛋白的提取率。比色法测得该苦瓜籽蛋白的等电点为3.0～5.0，所以pH在2.0～6.0，蛋白质发生沉淀使得可溶性蛋白含量降低，造成蛋白质提取率较低。由图2可知，当pH为10.0时，苦瓜籽蛋白的提取率达到最大18.98%。这可能是由于蛋白质在等电点附近溶解度最小，远离等电点时，溶解度增加，提取率增加；但pH为12.0时，可能蛋白质因变性而沉淀，提取率降低。所以当提取体系pH为10.0时，提取率达到最大。

图2 pH对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of pH on the protein extraction rate

2.2.3 搅拌时间的影响

由图3可知，随着搅拌时间的延长，苦瓜籽蛋白质提取率增大，4h后开始逐渐下降。这是由于随着搅拌时间的延长，溶液中的蛋白质出现凝聚而沉淀，离心后蛋白沉淀被去除，使蛋白质提取率降低[15]。当搅拌时间为4h时提取率最大，最大值为19.13%，因此最佳搅拌时间为4h。

图3 搅拌时间对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of stirring time on the protein extraction rate

2.3 正交试验结果

正交试验结果如表2所示，由表2可以看出，3个因素对试验结果影响的主次顺序为：A＞B＞C[16]，最佳提取组合为A2B1C3，即液料比为3.5∶1、pH为8.0、搅拌时间为5h。在此最佳提取条件下进行验证试验，苦瓜籽蛋白的提取率可达19.43%，根据文献[5]报道，该提取率处于较高水平。

表2 L9(33)正交试验表Tab.2 Orthogonal table

2.4 苦瓜籽蛋白的抗氧化性

2.4.1 苦瓜籽蛋白的还原能力

物质的还原能力与其抗氧化活性之间存在显著的相关性[17]。选用不同浓度的苦瓜籽蛋白样品，测定还原能力和浓度的关系，与维生素C作对比，结果如图4所示。

从图4中可以看出，苦瓜籽蛋白的还原能力虽然低于维生素C，但是也表现出了一定的还原能力，且其还原能力随蛋白质量浓度的增加而增大。苦瓜籽蛋白的还原能力为其抗氧化活性奠定了基础。

2.4.2 苦瓜籽蛋白对羟自由基(·OH)清除作用

羟自由基使番红花红褪色，因而根据褪色的程度来衡量·OH的清除效果[15]。选用不同质量浓度的苦瓜籽蛋白样品和维生素C，测定清除羟自由基的清除率和质量浓度的关系，IC50表示当清除率达到50%所需的样品质量浓度，结果如表3所示。

表3 苦瓜籽蛋白和维生素C对羟自由基(·OH)的清除率Tab.3 The elimination rate of the protein to·OH

由表3可知，苦瓜籽蛋白清除·OH的能力随着蛋白质量浓度的增加而增大，并且存在着一定的量效关系。当清除率达到50%时，所需的苦瓜籽蛋白和VC质量浓度分别为0.048 1和0.051 3mg／mL。从表3中可以看出，苦瓜籽蛋白样品具有较强的清除羟自由基的能力，其清除羟基自由基的能力与同等质量浓度的VC接近，最高可达91.7%，具有较强的清除羟自由基(·OH)的能力。

3 结 论

以苦瓜籽为原料，对苦瓜籽蛋白的提取方法、抗氧化性质进行了研究。结果表明，苦瓜籽中粗蛋白质量分数为39.6%；单因素试验结果表明，液料比为3.5∶1时，蛋白质提取率为16.28%；pH为10.0时，蛋白质提取率为18.98%；搅拌时间为4h时，蛋白质提取率为19.13%。正交试验结果表明，最佳提取条件为液料比3.5∶1、pH＝8、搅拌时间为5h，苦瓜籽蛋白的提取率可达19.43%。抗氧化性的结果表明，苦瓜籽蛋白具有一定的还原力，其还原力随着质量浓度的增加而增大；苦瓜籽蛋白清除·OH的能力随着蛋白质量浓度的增加而增大，其清除羟基自由基的能力与同等质量浓度的VC接近。

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