常压敞开式质谱成像技术及其应用*

冯鲍盛 白玉 刘虎威

(北京大学化学与分子工程学院 北京100871)

俗语说“一画胜千言”。一张图片可以很好地帮助人们理解非常复杂的道理。科学研究领域也是如此，图像可以帮助我们更好地、更直观地理解其背后的深奥科学原理以及相应的实验结果。因而，成像技术及其应用是目前科研领域的一个非常热门的研究方向。比如，在医院诊断中运用非常成熟的磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、正电子发射计算机断层显像(positron emission computed tomography，PET)和计算机断层扫描(computed tomography，CT)以及在实验室中经常使用的荧光成像、原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)和扫描隧道显微镜(scanning tunnel microscope，STM)等。商品化的MRI等技术可以直接对人体的组织进行无创的快速成像，但是其分辨率较低，只有1mm3～1cm3［1-2］。相比之下，荧光成像则可以达到非常高的分辨率［3］。由于荧光成像通常需要对目标分析物进行标记，因而会改变被分析物所处的原始环境，并可能造成标记后物质分布与标记前有所区别，从而不利于原位的分析和检测。AFM和STM两种技术虽然可以直接进行原子级别分辨率的成像，但它们不能对被测物质本身进行定性的分析［4］。

质谱成像(mass spectrometry imaging，MSI)是将成像处理软件与质谱的离子扫描技术相结合的一种新型成像方法。相对于传统的成像方法，质谱成像具有免荧光标记、不需要复杂样品前处理、可以提供丰富的被分析物空间分布信息等优点。与核磁共振或者正电子发射计算机断层显像相比，质谱成像有更高的空间分辨率;而相对于荧光成像，质谱成像所需的样品前处理步骤相对简单，而且不需要荧光标记，避免了可能引起的样品原始状态的改变。质谱技术可以根据被分析物的不同质荷比，分析从小分子到生物大分子等物质;结合成像技术，可以直观地给出较高分辨率的被分析物空间分布情况。因此，质谱成像技术越来越多地受到人们的关注，成为成像研究领域的一个新热点。

1 质谱成像技术及常压敞开式离子化质谱技术

质谱成像通常可以按照质谱分析所用的离子化方法进行分类。目前较为成熟的质谱成像商用仪器有两种:二次离子质谱(secondary ion mass spectrometry，SIMS)以及基质辅助激光解吸质谱(matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI-MS)。SIMS和MALDI-MS都属于解吸型离子化质谱(图1)。SIMS是在高真空环境中，利用高能初级离子束(例如Ar+、Au3+、等)轰击样品表面［5］，使得样品表面的一部分物质被解吸下来并离子化，产生的次级离子再进入质量分析器，进而被检测分析。SIMS可以达到目前质谱成像中最高的空间分辨率——几十纳米［6］，但由于其初级离子束能量较高，易产生碎片离子，其质量分析范围约2000kDa左右，对于大分子的检测灵敏度不高，因而其目前主要用于小分子化合物的质谱成像研究。MALDI是2002年获得诺贝尔奖的新型离子化方法，可以对生物蛋白质大分子进行离子化，大大拓宽了质谱的分析范围，也为质谱成像带来了新的可能。在MALDI-MS离子化过程中发挥最重要作用的是基质。在非成像的MALDI-MS分析过程中，被分析物和过量的基质混合共结晶，基质的量是被分析物的103～105倍［7］。MALDI的解吸和离子化是一个非常复杂的过程，基质吸收激光的能量，与被分析物共同解吸附到气相中，此过程中同时发生质子转移反应，使分析物在气相中带上电荷，进而进入质量分析器进行检测。在MALDI-MS成像过程中，首先需要在样品表面均匀喷涂上基质溶液。除了作为基质外，该溶液还可原位地将被分析物从样品中萃取，进而进行质谱分析［8］。MALDI-MS成像在质谱成像领域中的应用越来越广泛，但基质的喷涂可能造成小分子化合物以及蛋白质等待分析物的扩散和移位现象，此外，成像分辨率受限于激光光斑直径大小和共结晶的直径大小，一般在20μm左右［9-10］。基质的使用易对中低相对分子质量化合物的MALDI-MS成像造成干扰。

图1 MALDI-MS(A)和SIMS(B)原理示意图［8］

SIMS和MALDI-MS两种质谱成像技术的发展都较为成熟，且均有商品化仪器。它们的质谱扫描过程均需要在高真空条件下进行，无法进行实时原位的分析。随着2004年常压敞开式离子化质谱概念的提出［11］，各种各样的常压敞开式离子化技术纷纷涌现出来，为质谱成像技术的进一步发展提供了新的技术支持。

常压敞开式离子化技术主要有以下几方面特点［12］:①离子化过程在常压或者开放环境中进行;②无需或者只需简单的样品前处理;③可以和绝大多数的商品化质谱仪结合;④电离方式软，产生的碎片较少。根据文献报道，目前已经有几十种常压敞开式离子化方法。按照离子化过程和作用机理，大体可以分为以下几类［12-14］:1)基于喷雾和固液萃取的离子化技术:解吸电喷雾电离(desorption electrospray ionization，DESI)，探针电喷雾电离(probe electrospray ionization，PESI)，纳喷雾解吸电喷雾电离(nanospraydesorption electrospray ionization，nanoDESI)，萃取电喷雾电离(extractive electrospray ionization，EESI)，简易敞开式声波喷雾电离(easy ambient sonic spray ionization，EASI);2)基于等离子体的离子化技术:实时直接分析(direct analysis in real time，DAＲT)，低温等离子体(low-temperature plasma，LTP)，解吸电晕束电离(desorption corona beam ionization，DCBI);3)基于激光解吸消融的离子化技术:红外激光消融亚稳诱导化学离子化(infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IＲ-LAMICI))，电喷雾激光解吸电离(electrospray laser desorption ionization，ELDI)，激光消融电喷雾电离(laser ablation electrospray ionization，LAESI)，基质辅助激光解吸电喷雾电离(matrix-assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI);4)基于声波解吸的离子化技术:激光诱导声波解吸电喷雾电离(laser-induced acoustic desorption-electrosprayionization，LIAD-ESI)，射频声波解吸电离(radio-frequency acoustic desorption and ionization，ＲADIO)。

目前已经报道的用于质谱成像的常压敞开式离子化方法还不多。下面将对其进行详细的讨论。

2 常压敞开式离子化质谱成像

2.1 解吸电喷雾电离质谱成像

解吸电喷雾电离(desorption electrospray ionization，DESI)是第一种被报道的常压敞开式离子化技术［11］，也是目前常压敞开式离子化质谱成像领域研究最多的一种方法。

DESI是一种常压、常温、敞开式、原位、基本不需要样品前处理也不需要基质辅助的可以分析小分子和生物大分子的软电离技术［15］。如图2所示，在雾化气的带动下，溶剂在高压下形成电喷雾，并以一定角度吹扫样品表面;在与样品表面的分子接触过程中，将部分被分析物分子溶解，并且形成次级带电液滴束;次级带电液滴束以合适的角度喷入质谱入口，进而进行检测和分析。由于DESI基本不需要样品前处理或者额外的基质辅助就可以对待测物质进行检测，因而可将其用于样品的原位检测。但截至目前，DESI仍存在一些不足，如不同的电喷雾溶剂组成对样品表面分子的溶解和电离存在一定的选择性;此外，DESI成像的分辨率受其喷雾空间分辨率的限制，一般约为200μm。虽有报道可以通过优化实验条件将分辨率提高至40μm左右［16］，但与SIMS和MALDI-MS相比，分辨率仍较低。DESI作为一种新型的常压敞开式离子化技术，过去几年里在质谱成像领域已有诸多应用，如法医鉴定、组织成像、代谢物分析及三维组织成像分析等。

图2 DESI的原理示意图［11］

Ifa等人［17］报道了利用DESI-MS进行字迹鉴定以及成像方法的研究，他们采用逐行扫描的方式对样品数据进行采集，并利用成像软件将结果分析汇总得出成像结果。进而利用这一方法进行了笔迹［18］以及犯罪现场指纹［19］的质谱成像研究(图3)。Dill等人［20］报道了利用DESI-MS成像研究肿瘤细胞及胸腺组织切片上脂质的不同分布。Manicke等人［21］将高分辨的轨道阱质谱(orbitrap-MS)与DESI联用，对小鼠大脑的脂质进行了质谱成像，并比较了不同脂质的分布区别。Watrous等人［22］利用DESI-MS对枯草杆菌和链霉菌的二次代谢产物进行成像分析，为药物开发中天然产物的发现提供了新的有效途径。Lane等人［23］则报道了热带藻类组织表面的抗菌物质分布情况，为进一步研究其生理功能提供了基础。

图3 DESI指纹成像研究［19］

除了可以进行常规的二维成像分析，DESI-MS还可以对生物组织进行三维成像。Cooks等人利用该方法报道了小鼠脑中的脂质类化合物分布的三维质谱成像结果(图4)［24］。首先选择一片组织切片，确定了小鼠脑中的两种特征离子(m/z834.4为PS 18:0/22:6，m/z 888.8为ST 24:1)。然后将小鼠大脑组织切成36片，对每个切片分别进行成像，再将结果叠加起来，得到完整的三维小鼠大脑质谱成像图，证明了DESI-MS三维成像的可能性，并据此研究了小鼠大脑的特征物质分布情况。

图4 小鼠大脑DESI三维成像结果［24］

2.2 其他常压敞开式离子化质谱成像研究

2.2.1 低温等离子体质谱成像

低温等离子体(low-temperature plasma，LTP)［25］是一种新型的常压敞开式离子化技术，原理如图5所示。气体在电场放电作用下产生低温的等离子体，进而喷射到样品表面，使待测物质解吸并离子化。LTP的温度一般为30℃，载气为He、Ar或空气。其特点是对样品的损伤小，温度低，产生的离子碎片少。张新荣等人［26］报道了利用LTP低温无损等分析特点，对艺术品上的印章油墨成分进行质谱成像分析，实验中优化的成像扫描速度为270μm/s，等离子体直径为150μm。选取m/z71、83和116三个离子作为特征离子，对艺术品的真品和赝品进行了对比分析。

2.2.2 激光消融电喷雾电离质谱成像

Nemes等人［27］报道了一种将激光和ESI结合的新型常压敞开式离子化方法——激光消融电喷雾电离(laser ablation electrospray ionization，LAESI)。其实验所用到的激光为波长2940nm的红外激光，能量为3.5mJ，直径为350μm;ESI部分利用甲醇-水溶液(V(甲醇):V(水)=1:1)形成的电喷雾。其原理是被分析物先被激光消融解吸后再由电喷雾进行离子化并进入质量分析器进行检测(图6)。LAESI不需要任何的样品前处理过程，其质量检测范围涵盖了小分子到大分子，方法检测限为8fmol。方法的不足之处在于要求被分析体系含有一定量的水分。Nemes等人［28］利用LAESI-MS对富含水分的生物组织样品(例如小鼠大脑)进行了质谱成像;并利用LAESI的300μm二维空间分辨率和30～40μm的深度分辨率，将不同深度的独立二维成像结果相叠加，从而得到了三维的组织成像结果［29］。

图5 LTP-MS［25］

图6 LAESI-MS原理示意图［27］

2.2.3 红外激光消融亚稳诱导化学电离

Fernandez等人［30］报道了常压敞开式离子化技术——红外激光消融亚稳诱导化学电离(infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IR-LAMICI)，原理如图7所示。首先是用红外激光脉冲轰击样品表面，将其表面的分子消融并解吸;解吸下来的被分析物和处于激发态的亚稳态气体分子相互作用而离子化。利用激光有效提高质谱的空间分辨率，该装置可以较好地对小分子进行成像分析。利用IR-LAMICI-MS对药片进行质谱成像分析的结果见图8。

2.2.4 探针电喷雾电离质谱成像

图7 IR-LAMICI-MS原理示意图［30］

图8 IR-LAMICI-MS对药片中乙酰氨基苯酚单体(m/z=152)和二聚体(m/z=303)的质谱成像［30］

Hiraoka等人［31］报道了利用固体探针实现电喷雾的常压敞开式离子化方法——探针电喷雾电离(probe electrospray ionization，PESI)。PESI离子化方法利用电动马达驱动可上下竖直移动的固体探针，探针首先下降并接触样品，样品表面或内部的物质(视下降深度而定)粘附到探头上，从而完成采样。当探针上升到固定位置，在其上加3kV高压，从而在探针的尖端产生电喷雾，进而进入质量分析器进行检测。其原理如图9所示。Chen等人［32］报道了利用PESI对液体被分析物进行分析，对小鼠大脑组织进行了磷脂的质谱成像研究等。由于PESI的分辨率取决于探针尖端的直径大小，因此，实验利用很细的探针达到了60μm的高空间分辨率。

2.2.5 纳喷雾解吸电喷雾电离质谱成像

Laskin等人［33］报道了一种新型的常压敞开式离子化方法——纳喷雾解吸电喷雾电离(nanospray desorption electrospray ionization，nanoDESI)。其原理如图10所示，溶剂在初始毛细管和喷雾毛细管间形成液桥并接触样品表面，从而将被分析物从样品表面萃取出来。被分析物和溶剂在电场作用下，在喷雾毛细管中形成电喷雾，进而进入质谱进行检测与分析。Laskin等人［34］利用nanoDESI进行了质谱成像研究(其空间分辨率可以达到12μm)，并利用该装置对小鼠大脑的脂类分布进行了研究。

图9 PESI原理示意图［31］

图10 nanoDESI原理示意图及其空间分辨率研究［34］

3 总结与展望

经过几十年的发展，质谱成像已经成为成像研究领域的新热点。质谱成像的优点是在提供研究对象空间分布信息的同时，可以提供其丰富的分子结构信息，并且不需要对被分析物进行标记，也不需要复杂的样品前处理过程。更重要的是，成像分析之前不需要对被分析样品有很多的了解，是一种探索发现型的研究方法。现代质谱仪器的迅猛发展，为质谱成像提供了多种可供选择的离子化方法，以及具有更高分辨率、灵敏度以及分析速度的新型质谱仪，使得质谱成像技术成为病理学、生物化学以及制药分析等领域的有力工具。质谱成像通过给出被分析物的结构和分布信息，帮助人们认识重大疾病等研究过程中的问题和现象，有潜力成为实际医学应用等领域的常规分析方法。

截至目前，质谱成像技术仍有很多问题需要解决。例如成像的分辨率、灵敏度以及适用范围的进一步提高;规范化、快速的样品前处理方法的开发;质谱成像分析过程中自动化程度的提高;有效快捷的数据处理以及存储方案等。由于常压敞开式离子化技术可以实现真正意义上的原位分析，为质谱成像领域带来了新的发展;但目前成像的空间分辨率、灵敏度和重复性等都有待于进一步提升，这也是相关科技人员面临的挑战。

［1］LewellenTK.PhysMedBiol，2008，53:R287

［2］ZierhutML，Ozturk-IsikE，ChenAP，etal.JMagnResonImaging，2009，30:473

［3］GiepmansBNG，AdamsSR，EllismanMH，etal.Science，2006，312:217

［4］CourjonD，BainierC.RepProgPhys，1994，57:989

［5］WeibelD，WongS，LockyerN，etal.AnalChem，2003，75:1754

［6］SlodzianG，DaigneB，GirardF，etal.BiolCell，1992，74:43

［7］WoodsA.S，JacksonSN.AAPSJ，2006，8:E391

［8］ChughtaiK，HeerenRMA.ChemRev，2010，110:3237

［9］AerniHR，CornettDS，CaprioliRM.AnalChem，2006，78:827

［10］SchwartzSA，ReyzerML，CaprioliRM.JMassSpectrom，2003，38:699

［11］TakatsZ，WisemanJM，GologanB，etal.Science，2004，306:471

［12］HarrisGA，GalhenaAS，FernandezFM.AnalChem，2011，83:4508

［13］WestonDJ.Analyst，2010，135:661

［14］AlbericiRM，SimasRC，SanvidoGB，etal.AnalBioanalChem，2010，398:265

［15］IfaDR，WuCP，OuyangZ，etal.Analyst，2010，135:669

［16］KerteszV，VanBerkelGJ.RapidCommunMassSpectrom，2008，22:2639

［17］IfaDR，WisemanJM，SongQY，etal.IntJMassSpectrom，2007，259:8

［18］IfaDR，GumaeliusLM，EberlinLS，etal.Analyst，2007，132:461

［19］IfaDR，ManickeNE，DillAL，etal.Science，2008，321:805

［20］DillAL，IfaDR，ManickeNE，etal.JChromatogrB，2009，877:2883

［21］ManickeNE，DillAL，IfaDR，etal.JMassSpectrom，2010，45:223

［22］WatrousJ，HendricksN，MeehanM，etal.AnalChem，2010，82:1598

［23］LaneAL，NyadongL，GalhenaAS，etal.ProcNatlAcadSciUSA，2009，106:7314

［24］EberlinLS，IfaDR，WuC，etal.AngewChemIntEd，2010，49:873

［25］HarperJD，ChariparNA，MulliganCC，etal.AnalChem，2008，80:9097

［26］LiuYY，MaXX，LinZQ，etal.AngewChemIntEd，2010，49:4435

［27］NemesP，VertesA.AnalChem，2007，79:8098

［28］NemesP，WoodsAS，VertesA.AnalChem，2010，82:982

［29］NemesP，BartonAA，VertesA.AnalChem，2009，81:6668

［30］GalhenaAS，HarrisGA，NyadongL，etal.AnalChem，2010，82:2178

［31］HiraokaK，NishidateK，MoriK，etal.RapidCommunMassSpectrom，2007，21:3139

［32］ChenLC，YoshimuraK，YuZ，etal.JMassSpectrom，2009，44:1469

［33］RoachPJ，LaskinJ，LaskinA.Analyst，2010，135:2233

［34］LaskinJ，HealthBS，RoachPJ，etal.AnalChem，2012，84:141