电针对帕金森病模型大鼠黑质细胞线粒体复合物活性的影响

王彦春 王培峻 马 骏 许永海 梁少荣 何 方 周 丹 (湖北中医药大学，湖北 武汉 430061)

帕金林病(PD)的病因和发病机制迄今仍未彻底明确。针对线粒体功能改变的研究，对阐明PD的发病机制及指导临床治疗具有重要的意义。临床针对PD的治疗主要用多巴类药物以补充脑内DA的含量，改善患者症状，但不能抑制疾病的发展且具有明显的副作用。而针灸疗法能提高L-D A类药物疗效，降低药物剂量和减少并发症，有效减缓PD发展，是一种安全的自然疗法〔1，2〕，但机制不明。本实验通过观察电针对 PD模型大鼠的黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目及线粒体呼吸链复合物Ⅰ～Ⅳ活性的影响，初步探讨电针治疗PD。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 鱼藤酮(Rotenone)及葵花油乳化液(Sunflower oil)购于Sigma公司，水合氯醛、多聚甲醛、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠均为国产分析纯，即用型SABC免疫组化染色试剂盒，考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒，线粒体分离试剂盒、线粒体呼吸链复合物Ⅰ～Ⅳ活性比色法定量检测试剂盒购于GENMED公司。G6805电针治疗仪，低温超速离心机，752紫外可见分光光度计等。

1.2 实验动物 清洁级 SD大鼠48只，雄性，体重180～220 g，购于华中科技大学同济医学院实验中心，许可证号:SCXK(鄂)2004-0007。经过三次行为测试确认无自发行为异常后随机分为4组:①正常组;②溶剂对照组;③模型组;④电针治疗组。正常组不做任何处理，假手术组只注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化液，余下2组先造模，再作相应处理。

1.3 PD大鼠模型制备 将鱼藤酮溶解于葵花油乳化液中，浓度为2 mg/ml，棕色试剂瓶保存。取大鼠称重，采用颈背部皮下注射鱼藤酮法制备模型，注射剂量为2 mg·kg-1·d-1。每天注射一次，连续注射28 d，制备PD大鼠模型。通过观察大鼠的行为学改变及免疫组织化学技术检测中脑黑质神经元数目以确定PD模型造模成功。

1.4 电针治疗 电针治疗组大鼠自造模7 d后开始电针治疗，参照华兴邦《实验动物穴位图谱》〔3〕取风府、太冲(太冲穴隔天左右交替使用)，用0.5寸毫针针刺，接G6805电针治疗仪，连续波，频率2 Hz，每次治疗30 min，每天1次，治疗21 d。

1.5 行为学观察 自造模开始后，每天注意观察和记录各组大鼠的毛色、弓背、拒捕行为、不自主运动等行为。采用陈忻等〔4〕制定的鱼藤酮PD大鼠神经行为学评分体系对大鼠的行为学改变进行评分，记录造模7 d(开始电针治疗)及造模28 d(电针治疗结束)大鼠的行为学评分。

1.6 免疫组化染色检测TH的表达 每组随机选取6只大鼠以水合氯醛麻醉后，先用250 ml生理盐水行左心室灌流，再用0.1 mmol/L的PBS配制的4%的多聚甲醛溶液灌注固定。取出脑组织置于4%的多聚甲醛溶液中继续固定24 h，石蜡包埋后行连续冠状切。免疫组化SABC法检测TH。免疫组织化学图像采用Image-Pro Plus software对切片进行图像分析，所有切片均采用同一光强度，每个标本取相邻的3张切片，观察黑质区相同面积，分析阳性数密度及阳性面密度。

1.7 线粒体的提取 余下各组大鼠用水合氯醛麻醉后，于冰盘上迅速断头取出中脑黑质组织块，置于液氮罐中保存。使用GENMED动物组织线粒体分离试剂盒，采用组织匀浆法提取线粒体，放进-70℃冰箱中保存。

1.8 线粒体复合物Ⅰ～Ⅳ活性检测 运用线粒体复合物活性比色测定相应线粒体复合物的活性，具体的操作步骤参照定量检测试剂盒产品说明书用紫外分光光度法进行测定。

1.9 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析。组间差异采用t检验分析。结果以±s表示。

2 结果

2.1 电针对PD模型大鼠行为学的影响 自造模开始3～5 d后，模型组逐渐出现毛色变脏变黄、运动缓慢、弓背、拒捕行为减弱及震颤等不自主运动，且随着造模时间延长，上述表现逐步加重。电针治疗组自造模开始3～5 d后出现上述症状，但造模结束时电针治疗组大鼠行为学改变明显较模型组减轻，差异显著(P＜0.05)。正常组和溶剂对照组均未见上述行为学改变。见表1。

2.2 电针对PD模型大鼠中脑黑质区TH阳性神经元数目的影响 TH免疫组织化学染色显示，正常组和溶剂对照组大鼠中脑黑质区有条带状TH免疫反应阳性产物，分布较集中(63.17±7.47，64.67±5.96);与正常组及溶剂对照组相比，模型组大鼠中脑黑质区TH表达显著降低(25.33±3.88，P＜0.01);电针治疗组大鼠中脑黑质区TH表达较模型组显著增强(33.50±3.02，P ＜0.01)，见图1。

2.3 电针对PD模型大鼠中脑黑质区线粒体复合物Ⅰ～Ⅳ活性的影响 模型组线粒体复合物Ⅰ较正常组显著降低，电针治疗组线粒体复合物Ⅰ较模型组显著升高，正常组与溶剂对照组之间无显著差异。线粒体复合物Ⅱ～Ⅳ的活性在各组间无显著差异。见表2。

表1 模型组与电针治疗组大鼠行为学评分(±s，n=12)

表1 模型组与电针治疗组大鼠行为学评分(±s，n=12)

组别 造模7 d 造模28 d模型组1.5±0.53 6.8±1.35电针治疗组1.6±0.52 5.0±0.94

图1 各组大鼠脑黑质区TH阳性神经元的表达(TH，×200)

表2 各组大鼠脑黑质细胞线粒体复合物Ⅰ～Ⅳ的变化(±s，n=12)

表2 各组大鼠脑黑质细胞线粒体复合物Ⅰ～Ⅳ的变化(±s，n=12)

组别 ComplexⅠ ComplexⅡ ComplexⅢ ComplexⅣ正常组 111.42±13.25 44.88±6.39 39.33±4.98 90.23±11.11溶剂对照组 109.63±8.64 45.95±8.39 37.57±2.76 87.32±9.25模型组 51.61±3.67 42.97±8.53 34.03±4.15 91.47±10.16电针治疗组 77.65±6.32 43.55±11.35 34.50±3.16 93.35±8.17

3 讨论

线粒体是真核细胞内重要的细胞器，是有氧呼吸产生能量的主要场所。线粒体呼吸链主要由5个酶复合物 (复合物Ⅰ～Ⅴ)构成，是电子传递和最终合成 ATP的场所。复合物Ⅰ(NADH-CoQ还原酶)是线粒体呼吸链中最大的一个复合体，由NADH脱氢酶和一系列铁硫蛋白组成。它是由mtDNA转录的mRNA编码的亚单位组成，由于mtDNA易受自由基攻击以及缺少组蛋白的保护而易发生突变〔5〕。Parkin、PINK1、DJ-1等是常染色体隐性遗传性家族性PD常见的基因突变位点〔6，7〕。这些家族性PD相关基因编码蛋白对维持线粒体的形态和功能具有重要的作用，例如在Parkin敲除的小鼠中发现线粒体呼吸链活性降低〔8〕。相关实验也报道了PD模型动物的线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性明显下降〔9～11〕。显然，线粒体的功能障碍在PD的发病中占有重要的作用和地位。通过对整体鱼藤酮PD模型大鼠的研究观察到:动物出现行为学异常，线粒体复合物Ⅰ活性明显降低，而线粒体复合物Ⅱ～Ⅳ的活性无显著变化。通过对线粒体呼吸链整体水平的研究，证明鱼藤酮造成的黑质纹状体损伤与它抑制线粒体复合物Ⅰ的活性有直接的关系，由此推断鱼藤酮抑制线粒体复合物Ⅰ的活性是它选择性损害DA能神经元的始动性因素。同时更进一步证明了线粒体功能障碍在PD发病中的重要地位，尤其是线粒体复合物Ⅰ的功能。针灸是治疗PD重要的手段之一。临床多有报道针灸治疗该病不仅改善病人的症状，使美多巴减量而疗效不受影响，且西药引起的运动波动及异动症等副作用明显减轻〔12，13〕。本实验中，在大鼠出现行为学改变时，即对大鼠进行电针治疗，体现了中医的“未病先防，既病防变”思想。研究中观察到，电针治疗组线粒体复合物Ⅰ的活性较模型组明显增强，电针治疗组大鼠的行为学改变较模型组显著减轻，提示增强线粒体复合物Ⅰ活性、改善线粒体电子传递链功能可能是针刺治疗帕金森病的机制之一。

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2 任晓明.针灸治疗帕金森病的临床观察〔J〕.浙江中医药大学学报，2008;32(4):510-2.

3 华兴邦.大鼠穴位图谱的研制〔J〕.实验动物与动物实验，1991;1:1.

4 陈 忻，张 楠，赵 晖，等.鱼藤酮致帕金森大鼠行为学与黑质病理损伤的关系〔J〕.中国神经精神疾病杂志，2008;34(4):232-4.

5 Rego AC，Oliveira CR.Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis:implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases〔J〕.Neurochem Res，2003;28(10):1563-74.

6 Abou-Sleiman PM，Muqit MM，Wood NW.Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease〔J〕.Nat Rev Neurosci，2006;7(3):207-19.

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9 陈 忻，张 楠，厉 春.鱼藤酮帕金森大鼠呼吸链符合酶Ⅰ、Ⅳ的改变〔J〕.中国实验动物学报，2009;17(2):135-7.

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12 姜拯坤，雷 俊，马 骏.针刺风府、太冲穴治疗帕金森病〔J〕.湖北中医杂志，2011;33(4):65.

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