蛹虫草菌株的栽培与筛选

吴宪，张国财，张杰＊，王连宽，赵博，王婷玉，林连男，张卓然

（1.东北林业大学 生命科学学院，哈尔滨 150040；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040；3.大杨树林业局）

蛹虫草〔Cordyceps militaris（vuill.）Fr.〕又称北冬虫夏草、北虫草，属子囊菌类麦角菌目、麦角菌科、虫草属［1］。其药用价值与临床功效与天然冬虫夏草极为相似。天然冬虫夏草〔Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc〕是我国传统名贵中药，具有抗衰老、抗病原微生物、抗肿瘤等多种功效［2］。但至今未能实现有效的子实体人工培养及规模化生产，无法满足市场的大量需求。而人工栽培的北虫草作为野生虫草的替代品，市场空间大，效益高。因此，本文对6个蛹虫草菌株进行菌落培养、人工栽培，并对子实体生物转化率与主要活性物质含量进行分析比较，筛选出优良菌株，为规模化生产提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

1号菌株来自沈阳棋盘山；2号菌株来自沈阳于洪区；3号菌株来自辽宁锦州；4号菌株来自于东北林业大学生命科学学院；5、6号菌株均来自绥化市望奎县。以上蛹虫草菌株均保存于东北林业大学林学院森林保护学科实验室。

1.1.2 培养基

PDA加富培养基：马铃薯200g／L（煮汁），葡萄糖20g／L，蛋白胨5g／L，琼脂20g／L，KH2PO42g／L，MgSO41g／L，VB150mg／L。液体培养基：马铃薯200g／L（煮汁），葡萄糖20g／L，蛋白胨7g／L，KH2PO42g／L，MgSO4g／L，VB150mg／L。营养液：马铃薯200g／L（煮汁），KH2PO42g／L，MgSO41g／L，蛋白胨5g／L，取500mL培养瓶，每瓶加入小麦30g，培养液50mL，121℃灭菌40min，冷却过夜。

1.2 方法

1.2.1 菌落培养方法

用经灭菌直径为5mm打孔器取活化的蛹虫草菌片接种于PDA平板正中央，封口于22℃自然光下连续培养19d，每隔2d测定菌落直径，观察颜色变化，测定生长速率。

1.2.2 人工栽培方法

将活化后的蛹虫草菌饼接入装有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，22℃往复震荡培养7d，静置1d确保无杂菌后，用无菌水稀释5倍即为栽培用液体菌种。无菌操作接液体菌种5mL于培养瓶中，置于发菌室中于18℃，湿度为60%条件下，避光培养7d，待菌丝长满后在聚丙烯膜上扎眼，在22℃，环境湿度为80%～90%条件下培养45d，每日散射光照12h，记录形态，采收，60℃恒温烘干至恒重保存。

1.2.3 子实体营养成分测定

虫草酸含量测定［3］（甘露醇）：将干燥的子实体放入电动粉碎机中粉碎，取粉末2.5g于100mL烧瓶中，60mL 50%乙醇溶液，沸水浴进行3h回流，真空抽滤，收集滤液稀释2000倍后，取1mL于试管中依次加入1mL高碘酸钾稀盐酸溶液（15mmol／L），2mL鼠李糖溶液（1mg／mL），4mL新鲜Nash试剂，53℃水浴恒温15min，快速冷却后用紫外分光光度计测定其在412nm波长下吸光度。

粗多糖含量测定：取1g研磨好的子实体粉末加入5mL蒸馏水，20mL无水乙醇，涡旋震荡，超声30min，4000r／min离心10min，弃上清，沉淀用80%乙醇溶液清洗2次，加入蒸馏水50mL，沸水浴回流3h，过滤收集取上清液，稀释1000倍后备用，采用硫酸苯酚法测定［4］，紫外分光光度计测得490nm吸光度。

虫草素及腺苷含量测定［5］：取蛹虫草粉末1g加入6mL乙醚超声3次，3000r／min离心10min，弃上清，挥发尽乙醚，加入蒸馏水8mL，超声3次，过滤，合并滤液，60℃旋转蒸发仪蒸干，用6%乙腈溶液溶解，0.22μm滤膜过滤后备用。采用高效液相色谱法（HPLC）测定虫草素、腺苷含量：流动相：6%乙腈溶液；流速：0.6mL／min；检测波长：260nm；保留时间：15min。虫草素标准曲线方程：y＝2E－08 x＋4E－05，r＝0.9998；腺苷标准曲线方程：y＝2E－08 x－0.0003，r＝0.998。

2 结果分析

2.1 菌落培养实验结果

表1 不同菌株菌丝生长试验结果

由表1可知，2号菌株生长最快，菌落整齐，转色较好，3号菌株萌发迟缓、长势差、转色慢。

2.2 人工栽培试验结果

2.2.1 人工栽培子实体描述

2号与5号菌株子实体橙黄色，柄粗，头部膨大呈球形，部分头部发白，出草整齐均匀，长势密集；1号菌株橙黄色，柄细，子实体矮小，长势稀疏；4号子实体橙黄色，柄粗，子实体矮小，长势稀疏；3，6号菌株子实体橙黄色，柄粗细适中，长势疏密适中，子实体长度适中。

图1 不同菌株人工栽培子实体形态

2.2.2 人工栽培实验结果

每种菌株随机抽取30瓶蛹虫草进行样品处理，称得其鲜草重量、干草重量，计算出平均鲜重、干重以及鲜干比与生物转化率。由表2可知，2号菌株的平均干重和鲜重等均高于其它菌株。说明2号的产量最高，适用于大规模工业化生产。

表2 不同菌株人工栽培试验结果

2.3 子实体活性成分分析

提取并测定不同菌株中所含的活性物质：虫草酸、粗多糖、虫草素、腺苷的含量作为筛选优良菌株的重要指标。高效液相色谱法测定虫草酸、腺苷含量。由表3可知，2号菌株和5号菌株所含活性成分含量均高于其它菌株。

图2 高效液相色谱图

表3 不同菌株子实体活性成分分析试验结果 mg·g－1

3 结论

通过对不同蛹虫草菌株的菌丝生长状态的观察与生长速率的测定，人工栽培子实体形态的观察及生物转化率的测定以及对不同菌株子实体中活性成分的测定与分析，得出以下结论：6种蛹虫草菌株中的2号菌株菌丝萌发快、长势好，子实体形态优良、产量高，子实体中所含活性成分较高。适用于工业化大规模生产，是值得推广的优良菌种。

［1］ 吴畏，高新华，崔星明，等.北冬虫夏草（Cordyceps militaris）的研究应用概况（综述）［J］.上海农业学报，2000，16（增刊）：99－104.

［2］ Zhu J.S，Halpern G.M，Jones K，The scientific rediscovery of an ancient Chinese medicine herbal：Cordyceps sinensis［J］.Journal of Alternative and Complementary Medicine，1988，4（3）：289－303（I）；4（4）：429－457.

［3］ 葛新，白小兰，李云兰，等.分光光度法测定蛹虫草D－虫草酸的含量［J］.山西医科大学学报，2001，32（4）：317－318.

［4］ 白云娥，王毅，刘许媛，等.冬虫夏草、亚香棒虫草中多糖的含量测定［J］.中国医院药学杂志，2001，21（1）：19－20.

［5］ 潘锡强，张诗鸣，陈晓鸿.用HPLC法测定东方神草冲剂中腺苷的含量［J］.中成药，1994；16（10）：12－14.