AM251对糖尿病脑病大鼠认知功能和海马区细胞凋亡的影响

洪 艳 李 伟 赵 猛 (徐州医学院，江苏 徐州 22002)

糖尿病脑病是由于糖尿病糖代谢紊乱导致脑血管改变，损害了中枢神经系统，使大脑在结构、神经生理及神经精神等方面发生病理改变，以获得性认知行为缺陷为特征的糖尿病慢性并发症，是近几年受到研究者重视的糖尿病慢性中枢神经系统并发症，其机制可能为导致神经元兴奋性的增加和抑制性的减少，造成神经元的兴奋性毒作用〔1〕。海马CA1区锥体细胞突触膜上的AMPA受体介导中枢神经系统兴奋性突触传递，介导兴奋性损伤〔2〕。本实验通过选用CB1选择性拮抗剂AM251对1型糖尿病脑病大鼠进行干预，该干预措施如果能使AMPA受体相关蛋白N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白(NSF)及凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平下降，说明其对脑神经元的损害起到一定的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组、建模及干预方法 清洁级成年健康雄性SD大鼠30只(体重200～220 g，由徐州医学院实验动物中心提供)。随机分成3组:正常对照组10只(N组)，糖尿病组20只。糖尿病组通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg建立1型糖尿病脑病模型。正常对照组用常规饲料喂养4 w，3 ml 0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液腹腔注射，再喂养12 w;模型组高脂高糖饲料喂养4 w，65 mg/kg STZ腹腔注射喂养4 w后测血糖，血糖＞16.7 mmol/L判断为成模，以上大鼠均在相同环境下饲养，自由饮水、觅食。成模大鼠20只，随机分成2组:糖尿病脑病组(D组)和AM251干预组(A组)各10只。成模8 w后A组给予AM251腹腔注射0.5 mg·kg-1·d-1，干预4 w。N组和糖尿病组同期给予等量Tris缓冲液(pH7.4)腹腔注射4 w。

1.2 主要试剂 STZ购自Sigma公司，AM251购自北京宝希迪科技有限公司，NSF抗体购自上海宝曼生物科技有限公司。

1.3 标本的采集和保存 喂养16 w以后，Y迷宫检测学习记忆能力，在10%水合氯醛麻醉下，断头取脑，在冰上快速剥离出两侧海马组织，一侧置于1.5 ml EP管中置于-80℃冰箱冻存，用于Western印迹免疫印记实验;一侧用10%甲醛固定，用于免疫组织化学染色。

1.4 Y迷宫行为测试 Y-迷宫的控制仪有电压控制按钮、延时控制按钮、自动控制按钮和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、0四个按钮，当分别按下I、Ⅱ、Ⅲ按钮时，相应臂的信号灯亮，此时该臂不通电为安全区(红灯区)，另外无灯光的两臂及交界区均通电而成为非安全区(电击区)。按下0按钮，则三臂均不通电，但交界区通电。信号灯亮后，稍停片刻电栅才开始通电，这一短暂的间歇期由延时控制按钮调节。将大鼠放入迷宫箱某一臂，适应环境2～3 min后通电电击，致其一次性逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应，先进行学习，学会后记录其在30次电击中的正确次数。

1.5 检测细胞凋亡 将海马组织用PBS洗3次后于4%的多聚甲醛中固定25 min，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况。所用试剂盒为南京凯基生物有限公司提供。将用蛋白酶K消化后的切片用TUNEL液覆盖，37℃下孵育90 min;SSC终止反应，抗HRP抗体常温孵育15 min，PBS洗净，DAB呈色。光镜下凋亡细胞呈深浅不一的棕黄色。凋亡细胞半定量分析:根据凋亡细胞分布情况在400倍光镜下，每组切片拍摄5个阳性视野，每个视野计数100个凋亡的细胞，以计算平均凋亡细胞数所占百分比作为凋亡指数。

1.6 Western印迹检测NSF蛋白表达 新鲜海马称重后置于1.5 ml EP管中，加入匀浆液，于冰上充分匀浆，4℃、12 000 r/min离心5 min，弃沉淀，取上清，采用Folin测定总蛋白浓度后分装，-80℃冻存备用。采用10% 的分离胶，5%的浓缩胶，上样后80 V恒压电泳约20 min溴酚蓝至浓缩胶与分离胶交界处，换恒压100V电泳2 h，使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部，裁胶，半干转法将分离胶上的蛋白转移到NC膜上，恒流80 mA，70 min后取出NC膜，放入封闭液中，摇床封闭1 h。然后加入抗NSF抗体染膜进行一抗孵育过夜(4℃)。再加入相应的荧光二抗，避光静置1 h，Washing Buffer中避光摇床5 min×3次，计算机扫描纪录结果。

1.7 免疫组织化学检测NSF蛋白 石蜡包埋切片后先后放入二甲苯、乙醇Ⅰ、乙醇Ⅱ中进行脱蜡，双蒸水冲洗浸泡5 min×2次，微波炉中进行抗原修复，冷却后 PBS冲洗，3%H2O237℃ 10 min，双蒸水冲洗5 min×3次，以消除内源性过氧化物酶活性，滴加试剂A，加入一抗4℃过夜，复温后先后加入试剂B、C，PBS冲洗，DAB显色，自来水冲洗后苏木素复染，不同浓度的乙醇脱水，加入二甲苯透明，最后封片，读片。

2 结果

2.1 Y迷宫试验结果 30次Y迷宫检测实验，1型糖尿病脑病大鼠的认知水平与N组相比明显下降〔(11.24±1.41)次 vs(3.12±0.27)次，P＜0.05〕，但是当用 AM251治疗后的大鼠(A组)与D组相比，认知水平有了很明显的提高〔(8.38±0.85)次，P ＜0.05〕。

2.2 免疫组织化学法检测NSF蛋白结果 海马CA1区NSF含量在糖尿病脑病组较正常对照组明显增加 (P＜0.05)，而AM251治疗组与糖尿病脑病组比较，NSF表达减少(P＜0.05)。见图1，图2，表1。

表1 各组海马神经元凋亡率及NSF蛋白表达比较(n=5，±s)

表1 各组海马神经元凋亡率及NSF蛋白表达比较(n=5，±s)

与N组比较:1)P＜0.05;与D组比较:2)P＜0.05

组别 凋亡率(%) NSF蛋白(MOD)N组5.43±1.86 0.14±0.03 D组 48.61±7.361) 0.73±0.171)A组 23.34±6.222) 0.35±0.112)

3 讨论

糖尿病脑病是指糖尿病引起的认知障碍和大脑的神经生理及结构改变，表现为学习、记忆、解决问题的能力下降〔3〕，1型糖尿病认知功能损害主要在联想记忆和学习技能注意力方面〔4〕。糖尿病脑病的发病机制目前还没有完全明确，但已发现糖尿病脑病与大脑缺血、氧化应激、非酶性蛋白糖基化、胰岛素的副作用以及钙离子稳态的改变等有关。糖尿病引起的脑缺血、缺氧可导致神经元兴奋性的增加和抑制性的减少，造成神经元的兴奋性毒作用被认为是糖尿病脑病病理机制之一，因此也被作为治疗糖尿病脑病的关键靶点。NSF作为最有代表性的AMPA受体突触体内调节蛋白，自Block等〔5〕于1988年首次纯化出NSF以来，已被广泛应用于研究中，近年来的研究发现NSF有很广泛的组织分布特征，但优先表达在神经系统，而且在海马最多，提示其神经生理功能〔6〕。由于CB1受体则主要位于脑、脊髓与外周神经系统中，与记忆、认知、运动控制的调节有关〔7〕，而CB受体I型抑制剂AM251直接作用于中枢神经系统，所以表现出的活性也是多样的。国外报道多见于减肥、戒烟方面;国内报道主要关注改善记忆和认知障碍、治疗精神疾病方面，因此本实验使用AM251为干预措施，观察其在糖尿病脑病的治疗作用〔8〕。

本实验表明长期糖尿病大鼠存在NSF表达增高，与海马神经元凋亡增多有关，这可能是导致大鼠认知功能下降的原因;表明AM251可能通过降低NSF表达，改善糖尿病造成的海马神经元凋亡，提高治疗组大鼠认知能力。通过本实验，我们发现在长期的糖尿病代谢紊乱可导致糖尿病大鼠NSF表达增多，海马神经元凋亡增多，认知能力下降，可能参与糖尿病脑病的发生发展过程;而本实验通过选用CB1选择性拮抗剂AM251的干预，使大麻素受体中的1型受体(CB1)抑制从而下调NSF的表达，减少海马神经元凋亡，改善其认知功能，从而发挥治疗糖尿病脑病的作用。

1 孙海鸥，殷玉华，姬秋和.糖尿病脑病〔J〕.国外医学·内分泌学分册，2004;24(2):79-81.

2 Bredt DS，Nicoll RA.AMPA receptor trafficking at excitatory synapses〔J〕.Neuron，2003;40(2):361-79.

3 Alrarez EO，Beauquis J，Revsin Y，et al.Cognitive dysfunction and hippocampal changes in experimental type 1 diabetes〔J〕.Behav Brain Res，2009;198(1):224-30.

4 Strachan MW，Frier BM，Deary LJ.Type 2 diabetes and cognitive impairment〔J〕.Diabet Med，2003;20:1-2.

5 Block MR，Glick BS，Wilcox CA，et al.Purification of an N-ethylmaleimide sensitive protein catalyzing vascular transport〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1988;85(21):7852-6.

6 Puschel AW，Oconnor V，Betz H.The N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein(NSF)is preferentially expressed in the nervous system〔J〕.FEBS Lett，1994;347(1):55-8.

7 Pertwee RG.The pharmacology of cannabinoid receptors and their ligands:an overview〔J〕.Int J Obesity，2006;30(4):13-8.

8 Hou LC，Li N，Zheng LN，et al.CB1 cannabinoid receptor participates in the vascular hyporeactivity resulting from hemorrhagic shock in rats〔J〕.Chin Med J，2009;122(8):950-4.