恩度联合顺铂对胃癌种植瘤生长与血管生成的影响

李迪诺 王玉彬 王贵军 马艳梅 金 玥 (辽宁医学院附属第一医院胃肠外科，辽宁 锦州 121001)

恩度作为国产抗血管生成药物对肿瘤血管生成具有抑制作用〔1〕，被广泛应用于多种恶性肿瘤的辅助靶向治疗〔2〕，具有多靶点疗效可靠、副作用小、为细胞杀伤药物增敏等优点〔3〕。顺铂作为细胞毒性药物，在恶性肿瘤治疗中疗效被广泛认可〔4〕。本研究将两种药物相结合应用于裸鼠胃癌种植瘤，观察对细胞凋亡与肿瘤微血管生成的影响。

1 材料与方法

1.1 主要动物与试剂 Balb/c裸鼠购自大连医科大学实验动物中心，饲养于辽宁医学院SPF级实验动物中心;人胃癌细胞株SGC-7901购自协和细胞库，RPMI1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;Trizol试剂、RT-PCR试剂盒、Marker等均购自TaKaRa公司;PV二步法免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥公司;兔抗人 ID1、VEGF、CD34单克隆抗体及二抗IgG-HRP、β-actin均购自美国Santa Cruz公司;其他试剂均为国产分析纯。重组人血管内皮抑制素恩度、购自于烟台先声麦得津公司，顺铂购自锦州九泰药业;引物序列:ID1:正链5'-CAAGTGGCCAGAGGCATGCACTT-3'，负 链 5'-GATGTAGTCTTTACCATCCTGTTG-3';VEGF:正链5'-GAAGTGGTGAAGTTCAT-GGATGTC-3'，负链 5'-CGATCGTTCTGTATCACTCTTTCC-3'。引物由TaKaRa公司设计并合成。

1.2 人胃癌裸鼠种植瘤 用含有10%胎牛血清的RMPI1640培养基在37℃、5%CO2孵箱里常规培养，细胞长至80%培养瓶面积时，以0.25%胰酶37℃消化1 min，倒去胰酶，加入新鲜培养基，吹打至单细胞悬液，分装传代。传代3次，将SGC-7901细胞悬液种植于32只裸鼠腋窝皮下。

1.3 分组 Balb/c荷瘤裸鼠随机分四组，每组8只，成瘤直径0.8 cm后采用恩度及顺铂分别干预:对照组不处理，实验组1予5 mg/kg顺铂干预;实验组2予5 mg/kg恩度干预;实验组3予5 mg/kg恩度联合5 mg/kg顺铂干预。恩度隔1 d瘤周皮下给药一次，顺铂隔3 d腹腔给药一次，疗程4 w，开始治疗后每日观察裸鼠活动、摄食及饮水情况，每周用称体重。

1.4 取材 治疗4 w后，停药1 w，用水合氯醛麻醉处死裸鼠。取出肿瘤组织，检测体积及称重。

1.5 免疫组织化学检测 瘤组织蜡块包埋，切片，脱蜡，抗原修复。一抗兔抗人CD34用PBS以1∶50稀释，同时设PBS代替一抗作为阴性对照。二抗羊抗兔IgG-HRP以1∶200稀释。DAB显色，树胶封片观察。阳性标准为胞质及胞膜出现棕黄色颗粒，证实胃癌细胞表达CD34蛋白，微血管密度(MVD)采用Weidner微血管计数方法。

1.6 RT-PCR测定ID1、VEGF基因表达 各组新鲜冰冻组织标本按照RT-PCR试剂盒操作步骤，总RNA提取和RT-PCR扩增。循环参数为:95℃预变性10 min，94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸 2 min，30个循环之后，72℃再延伸 8 min。PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外分析仪观察后摄片。Lab Works软件进行凝胶成像分析，测定阳性电泳条带的平均灰度值，计算各样本目的基因与β-actin电泳条带的平均灰度值比值，作为其相对表达量。

1.7 Western印迹免疫印迹检测ID1、VEGF蛋白的表达 各组新鲜冰冻组织标本，预冷PBS洗3次后加入400 μl裂解液，冰上裂解细胞30 min，4℃ 14 000 r/min×5 min，提取上清测定蛋白质浓度后进行SDS-PAGE，转膜，含5%BSA的TBST室温封闭1 h，加入 ID1、VEGF 与 β-actin 抗体(1∶500)，4℃ 摇床过夜，加入二抗(1∶1 000)杂交，洗膜后显色。

1.8 透射电镜检测瘤组织凋亡情况 经4%戊二醛固定样品，0.1 mol/L PBS清洗 3次，每次 15 min;锇酸固定 2 h;0.1 mol/L PBS清洗3次，每次15 min。分别30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水，每次20 min，100%两次，每次30 min。包埋剂与丙酮混合液(1∶1)37℃浸透1 h，包埋剂与丙酮混合液(3∶1)浸透，37℃过夜;纯包埋剂37℃浸透24 h后包埋，60℃聚合48 h。Leica UCT超薄切片机切片，日立H-7500透射电镜观察凋亡情况。

1.9 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验及四格表确切概率法。

2 结果

2.1 裸鼠一般情况的变化 裸鼠成瘤前饮食、饮水及活动情况良好，四组间体重无差异。用药后顺铂组裸鼠活动明显减少，饮食量下降，体重下降，持续到实验结束。对照组、恩度组、恩度联合顺铂组裸鼠体重一直持续增长至实验结束(表1)。实验结束时，顺铂组裸鼠体重较其余各组裸鼠体重明显减少(P＜0.05)，对照组与恩度组裸鼠体重之间比较差异没有统计学意义(P=0.53)，但是恩度联合顺铂组裸鼠体重分别与对照组和恩度组之间裸鼠体重比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 裸鼠体重量表(±s，n=8，g)

表1 裸鼠体重量表(±s，n=8，g)

组别 初始体重 结束体重恩度联合顺铂组18.26±0.35 19.75±0.33恩度组 18.17±0.73 22.50±0.59顺铂组 17.99±0.41 14.21±0.83对照组18.62±0.74 21.98±0.91

2.2 裸鼠肿瘤体积的变化 四组裸鼠皮下移植瘤体积随实验进行逐渐增长，对照组体积增长迅速，而顺铂组、恩度组、恩度联合顺铂组体积增长缓慢。实验结束时，恩度联合顺铂组、恩度组、顺铂组、对照组裸鼠体积依次为(0.29±0.13)、(0.52±0.29)、(0.60±0.31)、(1.29 ±0.65)cm3。各组肿瘤体积之间的差异有统计学意义(P=0.032＜0.05)。其中，对照组分别与顺铂组、恩度组、恩度联合顺铂组之间两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而顺铂组、恩度组和恩度联合顺铂组之间两两比较差异没有统计学意义(P＞0.05)。结果表明恩度可以抑制裸鼠肿瘤的生长，但是没有消瘤作用。

2.3 裸鼠肿瘤的质量变化 实验结束时，恩度联合顺铂组、恩度组、顺铂组、对照组裸鼠肿瘤质量依次为(0.43±0.25)、(0.84±0.33)、(0.79±0.26)、(1.81±0.75)g。对照组分别与顺铂组、恩度组和恩度联合顺铂组之间两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而顺铂组、恩度组和恩度联合顺铂组之间两两比较差异没有统计学意义(P＞0.05)。

2.4 免疫组化结果 各组之间微血管密度的差异有统计学意义(P=0.000)(图1)，恩度组、恩度联合顺铂组肿瘤血管的抑制作用较明显，两组MVD分别为11.38±1.25和10.93±1.54，差异没有统计学意义(P＞0.05)，而分别与顺铂组(16.17±1.33)、对照组(23.73±2.40)MVD比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，顺铂组与对照组之间MVD比较也有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 RT-PCR检测结果 与对照组相比，恩度组和恩度联合顺铂组ID1和VEGF mRNA表达明显降低(P＜0.05);而顺铂组和对照组之间ID1和VEGF mRNA表达没有显著性差异(P＞0.05)(图2)。

2.6 Western印迹检测结果 与对照组相比，恩度组和恩度联合顺铂组ID1和VEGF蛋白表达量明显降低(P＜0.05);而顺铂组和对照组之间ID1和VEGF蛋白表达量没有显著性差异(P＞0.05)。见图3。

2.7 裸鼠肿瘤细胞超微结构变化 在透射电镜下观察，恩度组和恩度联合顺铂组的裸鼠肿瘤细胞均发现有凋亡细胞，表现为可见核碎裂块，粗面内质网轻度扩张，有脱颗粒现象，线粒体髓样化(图4)。在对照组和顺铂组内并未见到细胞凋亡情况，而是发现大量变性坏死的细胞，表现为线粒体大部分嵴消失，线粒体膜缺损，线粒体髓样化，胞质水肿有变性坏死，粗面内质网高度扩张，有脱颗粒现象(图4)。结果显示恩度不仅可以抑制肿瘤新生血管的生成，还通过促进肿瘤细胞凋亡而直接抑制部分肿瘤细胞的增殖，进而达到抑制肿瘤的作用。

图1 各组微血管密度比较(胞质中的棕色颗粒为高表达的CD34蛋白(×100)

3 讨论

恩度是我国自主研发的多靶点抗肿瘤血管生成药物。恩度大量的临床前与临床试验肯定了恩度作为新型靶向抗肿瘤药物的有效性与安全性〔5〕。恩度的优势有〔6～8〕:靶点直接暴露于血液中，便于药物直接作用;靶点基因表达稳定，不易产生抗药性;无需考虑肿瘤组织学特异性;可以抑制肿瘤转移;有下游放大效应;不良反应相对较少。恩度与放、化疗联合具有协同作用:(1)可使肿瘤区血管生成正常化，组织间高压减轻，利于化疗药向肿瘤区输送。(2)放、化疗所致局部肿瘤区缺氧可促VEGF表达，帮助肿瘤细胞抵抗放、化疗的凋亡诱导机制;而联用恩度将预防此继发保护效应，使治疗反应增敏。

顺铂是细胞毒性药物，抗肿瘤作用显著〔9〕。本实验中实验各组均表现为瘤体减小，表明细胞杀伤与抑制血管生成均能够抑制裸鼠胃癌种植瘤的生长;但实验各组间比较无明显差异，可能由于肿瘤生长时间以及药物作用时间和浓度造成差异无显著性。单用顺铂组的裸鼠体重下降非常明显，裸鼠消瘦，而单用恩度组和恩度与顺铂联合组的裸鼠体重是逐渐增长的，可见恩度可以降低化疗药引起的裸鼠体重下降等副作用。MVD免疫组化结果显示，恩度与联合组对MVD抑制效果明显，顺铂组与对照组抑制效果明显低于恩度与联合组，表明恩度具有明显的血管抑制效果。有文献证实恩度对微血管密度的抑制作用是通过抑制VEGF上游因子ID1表达实现的，本研究结果显示与上述理论相符，而顺铂对该因子的作用效果不显著。透射电镜结果显示恩度作用发现后细胞凋亡现象;而在对照组和顺铂组内并未发现确实的凋亡现象，可以进一步认为恩度不仅可以抑制肿瘤新生血管的生成，还通过促进肿瘤细胞凋亡而直接抑制部分肿瘤细胞的增殖，进而达到抑制肿瘤的作用。

综上所述，本试验发现恩度可以通过降低ID1的表达抑制血管的新生，从而达到抑制肿瘤生长和转移的效果，为胃癌的新辅助化疗提供了一种新的思路。

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