靶向血管内皮细胞因子受体3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建

吕志诚，苏芝兰，杨文元，张锋军

(1.兰州军区兰州总医院 干四科，甘肃兰州 730050;2.甘肃武威市医院 消化科，甘肃武威 733000)

靶向血管内皮细胞因子受体3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建

吕志诚1，苏芝兰2，杨文元1，张锋军1

(1.兰州军区兰州总医院 干四科，甘肃兰州 730050;2.甘肃武威市医院 消化科，甘肃武威 733000)

目的 构建靶向血管内皮细胞因子受体3(VEGFR-3)的小干扰RNA重组腺病毒表达载体。方法 将构建的靶向VEGFR-3特异性小干扰RNA真核表达载体pGenesil-siRNA的启动子及siRNA序列克隆入穿梭质粒pAdTrack，将质粒线性化处理后转化入pAdEasy。重组腺病毒载体线性化处理后转染HEK293细胞，包装重组腺病毒，并进行PCR鉴定、病毒滴度测定;扩增后感染结肠癌LoVo细胞并进行Western blotting检测VEGFR-3蛋白的表达。结果 双酶切鉴定及测序证实pAdTrack-pG-siRNA及pAd-VEGFR3-siRNA质粒构建正确，扩增纯化测定重组病毒pAd-VEGFR3-siRNA的滴度为5.6×109pfu/mL。病毒感染结肠癌LoVo细胞后测定VEGFR-3蛋白表达明显降低。结论 靶向VEGFR-3小干扰RNA的腺病毒载体构建成功。

VEGFR-3基因;RNA干扰;腺病毒;表达载体

淋巴转移是恶性肿瘤主要的转移途径之一，也是恶性肿瘤评价预后的一个很重要的独立因素;与血管转移的研究相比，淋巴转移的研究相对滞后。淋巴管生成及其调控机制以及淋巴管生成在肿瘤生长和转移中的作用已成为恶性肿瘤研究领域中的一项重要课题。许多研究认为，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族参与了肿瘤的生长和淋巴管的生成，促进了肿瘤细胞向区域淋巴结的转移［1-3］。其中血管内皮细胞生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR-3)是内皮特异性的受体酪氨酸激酶，其配体VEGF-C、D和它结合后促进淋巴管的增生。在许多恶性肿瘤组织中，VEGFR-3均有高表达。阻断VEGFR-3的信号通路则可能成为一种新型的广谱性治疗肿瘤的手段。本研究通过构建VEGFR-3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建，为下一步阻断VEGFR-3在肿瘤淋巴转移和生长中作用的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

靶向VEGFR-3的pGenesil-siRNA由晶赛公司合成，pAdTrack、pAdEasy-1 质粒、DH5α、BJ5183菌种、HEK293细胞由兰州军区兰州总医院实验室提供，PCR试剂盒、T4DNA连接酶及限制性内切酶SalI、HindⅢ、EcoRI购自日本 Takara公司，PacI购自美国NEB公司，质粒小量抽提试剂盒与胶回收试剂盒购于Omega公司;脂质体2000购于Invitrogen公司。

1.2 方 法

1.2.1 腺病毒穿梭载体pAdTrack-pG-siRNA的构建:将 pGenesil-siRNA和腺病毒穿梭质粒pAdTrack用HindⅢ和SalI双酶切，回收片段在4℃条件下T4DNA连接酶连接过夜，阳性克隆HindⅢ和SalI双酶切鉴定，EcoRI单酶切鉴定，进一步经DNA双向测序确认构建无误，命名为pAdTrackpG-siRNA质粒。

1.2.2 重组腺病毒表达载体pAdEasy-pG-siRNA的构建:pAdTrack-pG-siRNA用PmeI酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染感受态细菌BJ5183，在浓度为50 mg/L卡那霉素抗性LB平板上筛选，37℃培养18～20 h后，挑选阳性克隆4个，扩增后抽提DAN，用PmeI酶切处理鉴定正确后，将质粒转化DH5α感受态细胞，用PCR及PacI酶切鉴定。获得的重组腺病毒载体命名为pAd-VEGFR3-siRNA。大量抽提重组腺病毒载体质粒pAd-VEGFR3-siRNA备用。

1.2.3 重组腺病毒 pAd-VEGFR3-siRNA的包装、扩增:用PacI充分线性化pAd-VEGFR3-siRNA后，按照Lipofectamine 2000操作说明将线性化的PAd-VEGFR3-siRNA加入脂质体稀释液中轻轻混合，室温下静置20 min使其充分结合形成复合物。将混合物加入已达70%～80%贴壁融合的HEK293细胞中，轻轻混合。定期用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。7天后80%左右细胞出现细胞病变效应。收集细胞后分别于-80℃，37℃中反复冻融3次裂解后离心，收集病毒上清，继续感染HEK293是细胞以扩增病毒，重复扩增3轮。第一批上清液进行PCR鉴定，重组的病毒颗粒反复感染HEK293是细胞进行大量扩增。病毒液用0.22 μm 滤膜无菌过滤后分装于1.5 mL冻存管，-80℃保存。

1.2.4 重组腺病毒pAd-VEGFR3-siRNA RTPCR鉴定:取第一轮扩增后收集的病毒上清5 μL，加入10 μL蛋白酶K，55℃孵育1 h，100℃沸腾5 min，离心后取1～2 μL上清进行PCR鉴定。其引物序列为:上游引物5＇-CATGAGAAGT ATGACAACAGCCT -3＇，下游引物5＇-AGTCCTTCCAC GATACCA AAGT -3＇，长度约450 bp。

1.2.5 重组腺病毒pAd-VEGFR3-siRNA的纯化及病毒滴度:将HEK293细胞稀释至105个/mL后，在96孔板上按每孔100 μL接种细胞，常规培养12 h，将收获的重组病毒子按1×103～1×1010进行倍比稀释后，每个稀释度按每孔100 μL接种，同一浓度做3个复孔，常规培养6 h后更换为新鲜培养液继续培养24 h，荧光显微镜下进行观察。按病毒效价(pfu/mL)=(荧光数×10)/稀释度计算病毒效价。

1.2.6 细胞培养和转导:将复苏后的结肠癌LoVo细胞在37℃、5%CO2的培养箱中培养，培养液为含10%胎牛血清的LB培养液。待其在生长倍数期时，用胰酶消化，接种6孔板，按50 MOI的量接种病毒，留1孔不加病毒作为空白对照，培养箱中感染3 h;然后弃尽培养上清，加入新鲜培养液继续培养24 h。荧光显微镜下观察感染效率，收集细胞，加入预冷的细胞裂解液提取细胞总蛋白，进行 Western blotting检测。将总蛋白变性后，进行SDS-PAGE凝胶电泳与转膜，VEGFR-3(1∶500)、β-actin抗体(1∶1 000)孵育，4 ℃过夜，TBST 洗2次 ×10 min，分别加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗2次×5 min。将滤膜放入配好的显色液中显色15～30 min，取出滤膜，蒸馏水冲洗，晾干，扫描。

2 结 果

2.1 腺病毒穿梭载体和骨架质粒的鉴定

HindⅢ和SalI双酶切重组穿梭质粒pAdTrackpG-siRNA后，琼脂糖电泳检测到大小分别8300 bp大片段和409 bp的目的基因片段，表明构建成功(图1)。阳性质粒经测序鉴定后，结果提示该质粒构建成功。pAdTrack-pG-siRNA线性化并转入感受态pAdEasy-1中，同源重组后筛选出阳性克隆，用PacI酶切，0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示出约30 kb的大片段和4.5 kb左右的小片段各一条(图2)。表明pAd-VEGFR3-siRNA质粒已重组成功。

2.2 重组腺病毒的包装和扩增

重组腺病毒转染HEK-293细胞24 h后荧光显微镜下可见少量细胞有GFP表达，GFP的表达随着时间的延长强度逐渐增加而逐渐增多，取适量鉴定正确的病毒上清重复感染HEK-293细胞，扩增后收集病毒液(图3)。

2.3 腺病毒PCR鉴定

重组病毒可以扩增出450 bp的片段(图4)，而空病毒未扩增得到相应片段。说明含VEGFR3-siRNA基因的pAdTrack-pG-siRNA已与腺病毒核心基因组pAdEasy-1发生了重组，并且重组腺病毒包装成功。

2.4 重组腺病毒滴度测定

pAd-VEGFR3-siRNA经繁殖、扩增后将细胞悬液后滴加于计数板上，用GFP阳性计数法计数细胞总数，腺病毒载体滴度为5.6×109pfu/mL。

2.5 结肠癌LoVo细胞中VEGFR-3蛋白表达的检测

Western blotting结果(图5)显示，受感染pAd-VEGFR3-siRNA结肠癌LoVo细胞中VEGFR-3蛋白表达较阴性对照组明显降低。

图5 VEGFR-3的Western blotting检测结果Fig 5 Results of VEGFR-3 protein expression by western blotting

3 讨 论

血管内皮生长因子受体3(vascular endothelia growth factor receptor 3，VEGFR-3)是血管内皮受体家族的重要成员之一，隶属于膜受体介导的酪氨酸蛋白激酶受体家族，主要参与淋巴管血管生成［4-5］。恶性肿瘤尤其是胃肠道肿瘤，在晚期均会发生淋巴转移，大多数晚期恶性肿瘤均不能通过手术治愈或延长生命，药物治疗是晚期肿瘤重要的治疗手段之一。因此阻断淋巴管生成的研究就显得极为重要。

许多文献认为，VEGF-C/-D和VEGFR-3结合诱导内皮细胞的增殖和迁移，调控淋巴管的生成，可以促进肿瘤细胞的淋巴转移，在非小细胞肺癌，大肠癌，子宫内膜癌，卵巢癌，原发性乳腺癌，前列腺癌，胃癌中VEGFR–3表达与患者的生存时间有相关性，且认为VEGFR-3是一个独立的预后因素;VEGFR-3的高表达与淋巴管浸润，淋巴结转移及不良生存预后相关［6-12］。因此通过抑制肿瘤细胞的VEGFR-3基因表达来阻断其信号传导，抑制肿瘤淋巴管血管生成，可能会成为治疗恶性肿瘤、阻断淋巴转移的直接、有效的手段。

siRNA技术作为一种新型的转录后基因沉默技术，是疾病基因疗法的理想工具。制备siRNA的方法主要有体外化学合成和DNA载体细胞内表达siRNA两种，由于其高稳定性、高效性、高特异性、高穿透性，发挥RNA抑制肿瘤基因表达，因此是肿瘤的靶向治疗的一个新途径。但由于化学合成和载体表达的siRNA对靶细胞抑制是暂时或瞬间性的，而且转染效率较低及不能持续表达，限制了其作为肿瘤治疗的一种有效途径的广泛应用。而腺病毒载体容易复制、能有效增值、病毒滴度高、易于浓缩及储存，即可以感染分裂细胞又可以转染静止细胞，还可以进行活体感染，进入细胞内并不整合到宿主细胞的基因组，安全性非常高，适用于基因治疗。

本研究通过构建靶向VEGFR-3小干扰RNA真核表达载体，进一步将小干扰RNA表达载体和缺陷型腺病毒重组，以便高效转染哺乳细胞，提高细胞中VEGFR-3基因沉默效率，达到阻止或减少淋巴管生成的目的。经PCR、Western blotting、双酶切及测序，证明成功构建了携带VEGFR-3 siRNA基因片段的重组腺病毒载体，并获得了较高的病毒滴度，可以高效感染结肠癌LoVo细胞系。这对利用构建的重组腺病毒转染哺乳动物细胞组织，并在转染细胞获得高效表达，体内诱导靶细胞VEGFR-3小干扰RNA，阻断淋巴管生成而达到抗肿瘤淋巴道转移的目的奠定了基础。

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Construction of the recombinant adenovirus expressing the short interfering RNA targeting vascular endothelia growth factor receptor 3 gene

LV Zhi-cheng，SU Zhi-lan，YANG Wen -yuan，ZHANG Feng -jun

(1.Department of Oncology，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area，Lanzhou730050，China;2.Department of Gastroenterology，Gansu Wuwei City＇s Hospital，Wuwei733000，China)

［Abstract］ObjectiveTo construct the recombinant adenovirus expression vector of a short interfering RNA(siRNA)targeting Vascular endothelia growth factor receptor 3(VEGFR -3)gene.MethodsThe pGenesil-siRNA expression vector promoter and siRNA，which was constructed，were subcloned to pAdTrack shuttle plasmid.The product was linearized and recombinated with pAdEasy.After linearization by PacI，the recombinant adenovirus plasmid was transfected into 293 cells for packaging and amplification，then was further identified by PCR analysis.Western blotting was used to detect the expression of VEGFR - 3 protein in the colorectal cancer cell lines LoVo infected with the adenovirus.ResultsThe pAdTrack-pG-shRNA andpAd-VEGFR3-siRNA plasmids had been successfully constructed.The titer of the recombinant virus pAd-VEGFR3 -siRNA was 5.6×109pfu/mL after amplificated and purified.VEGFR -3 protein expression decreased significantly in the colorectal cancer LoVo cells lines after infection by the recombinant virus.ConclusionWe have successfully constructed the recombinant adenovirus pAd-VEGFR3-siRNA targeting VEGFR-3 gene.

［Key words］VEGFR -3;RNA interference;adenovirus;expression vector

R321

A

1671-7295(2013)02-0139-04

吕志诚，苏芝兰，杨文元，等.靶向血管内皮细胞因子受体3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建［J］.大连医科大学学报，2013，35(2):139 -142.

10.11724/jdmu.2013.02.10

吕志诚(1969-)，男，甘肃永昌人，博士。E-mail:lyuzc@sohu.com

2012-11-04;

2013-01-20)