亚慢性铅暴露小鼠睾丸组织铅蓄积及对精子质量影响

金河田，王晓旭，朴丰源

(1.沈阳202医院放射治疗中心，辽宁沈阳 110000;2.大连医科大学 劳动卫生与环境学教研室，辽宁 大连 116044)

亚慢性铅暴露小鼠睾丸组织铅蓄积及对精子质量影响

金河田1，王晓旭2，朴丰源2

(1.沈阳202医院放射治疗中心，辽宁沈阳 110000;2.大连医科大学 劳动卫生与环境学教研室，辽宁 大连 116044)

目的 观察亚慢性铅暴露小鼠睾丸组织铅蓄积和对小鼠精子质量影响，并探讨二者的关联性。方法昆明种小鼠60只，按体重将小鼠随机分为对照组、0.5 g/L、1.0 g/L和1.5 g/L醋酸铅染毒组。通过自然饮用含不同浓度醋酸铅水的方式使小鼠染铅，连续染毒60 d后取附睾和睾丸组织。用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测小鼠睾丸组织的铅浓度，常规方法检测附睾精子质量，并用统计学方法对二者的相关性进行分析。结果 0.5 g/L、1.0 g/L 和1.5 g/L 染铅组小鼠精子的活动度分别为87.3%、79.2%和68.3%，显著低于对照组(94.1%)(P＜0.05)。各铅暴露小鼠精子畸形率分别为15.2%、32.8%和35.5%，显著高于对照组(7.0%)(P＜0.05)。各铅暴露小鼠睾丸组织铅浓度分别为72.71 ng/g，118.74 ng/g和177.14 ng/g，显著高于对照组(9.73 ng/g)(P＜0.05)，并随染毒剂量增加而升高。而且，铅暴露小鼠睾丸铅浓度与精子的活动率、密度和存活率之间呈显著负相关(P＜0.05)。结论 亚慢性铅暴露可导致小鼠睾丸组织铅蓄积，铅在睾丸组织蓄积可能是亚慢性暴露小鼠精子质量下降的重要因素。

醋酸铅;雄性生殖毒性;铅蓄积;精子质量

随着经济快速发展，环境污染日趋严重。其中，有毒重金属铅是最常见的环境污染物。人群流行病学调查和试验研究均表明，铅暴露对精子的发生、发育及成熟具有明显的抑制作用，引起精子数量减少、精子活力减弱和畸形率增高［1-2］，能导致配偶不良妊娠过程和结局并影响子代发育。铅的上述雄性生殖毒作用严重影响接触铅育龄人群的生育能力，尤其对于优生优育，给他们的家庭带来极大痛苦，已引起国内外学者的高度关注。

为了观察亚慢性铅暴露小鼠睾丸组织铅蓄积和对小鼠精子质量影响及探讨二者的关联性，本研究通过使小鼠亚慢性染醋酸铅制作铅中毒动物模型，用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测小鼠睾丸组织的铅浓度，常规方法检测附睾精子质量，并用统计学方法对二者的相关性进行了分析。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

醋酸铅(上海化学试剂厂);高级纯硝酸(HNO3);优级纯过氧化氢 (H2O2);Mili-Q超纯水。HNO3、H2O2和Mili-Q超纯水购于西格玛化学公司(西格玛，美国)。电感耦合等离子体质谱仪(Agilent 7500ce，安捷伦科技有限公司，美国加利福尼亚州)。

1.2 实验动物分组及处理

成熟健康昆明种雄性小鼠60只，体重为(20±2)g，由大连医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(辽)2008-0002。小鼠按体重随机分为4组，每组15只。即对照组、0.5 g/L醋酸铅染毒组、1.0 g/L醋酸铅染毒组和1.5 g/L醋酸铅染毒组。通过饮用含不同浓度醋酸铅水的方式使小鼠染铅。饲养小鼠的室内条件如室温(22±2)°C、湿度(60±5)%等被严格监控，小鼠可以任意饮水和取食(标准食物)，连续染毒60 d。

1.3 样品处理及铅浓度分析

染毒结束后处死小鼠，取睾丸组织样品0.2～0.3 g，置于100 mL聚四氟乙烯消解罐内，样品中分别加入 5 mL HNO3，2 mL H2O2，浸泡 30 min 后，入微波炉中，消解结束后取出至室温，用Mili-Q超纯水将样品定容20 mL定容上机测定。Agilent 7500ce型ICP-MS检测器测定Pb的浓度，Ge为内参，检出限为12 ng/L。

1.4 精液质量分析

每只小鼠的附睾放入盛有1 mL 0.9%生理盐水的小烧杯中，用眼科剪将附睾纵向剪1～2刀，静止3～5 min，轻轻摇动，使精液液化。

1.4.1 精子活动力的分级测定:WHO建议将精子活动力分为4级［3］。a.快速前向运动;b.慢或呆滞的前向运动;c.分前向运动;d.不动。其操作方法:取液化均匀的精液1滴置于载玻片上，盖上盖玻片，放置片刻，在高倍镜下观察10个视野，计数1 000个精子并进行分级，计算每类精子的数量，以百分率表示。

1.4.2 精子畸形率测定:取液化均匀的精液，用4层擦镜纸过滤，吸滤液涂片。空气干燥后，用甲醇固定5 min以上干燥。用1% ～2%伊红染色1 h，用水轻冲，干燥。在高倍镜下观察10个视野，计数1 000个精子中着色和不着色的精子数即为精子存活率。1.4.3 精子密度测定:取液化均匀的精液1滴，置于血细胞计数板上，盖上盖玻片，在高倍视野下，计数细胞板中间有25个方格(每个方格中又有16个小方格)的精子总数×106mL，即为精子密度。

1.4.4 精子存活率测定:取液化均匀的精液1滴置于载玻片上，1滴精液加等量的5%伊红Y(用pH 7.4的磷酸缓冲液配制)混匀，2 min后推成薄片，自然干燥片刻，镜检。活精子不着色，死精子着红色。在高倍镜下观察10个视野，计数1 000个精子中着色和不着色的精子数即为精子存活率。

1.5 统计学方法

计量资料结果用均数±标准差形式表示，应用SPSS16.0统计软件对数据进行统计分析。分析计量资料的组间差异，采用单因素方差分析(ANOVA)Scheffe’s多重比较;计数资料的组间差异，采用χ2分析;对于铅暴露小鼠睾丸组织中铅含量与精子活动率、精子畸形率、精子密度和精子存活率的相关关系采用线性回归分析(linear regression analysis)，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠睾丸组织铅浓度

对照组小鼠睾丸组织铅浓度为9.73 ng/g，而0.5 g/L、1.0 g/L 和 1.5 g/L 染铅组小鼠睾丸组织铅浓度分别为 72.71 ng/g，118.74 ng/g 和 177.14 ng/g，各实验组铅浓度显著高于对照组(P＜0.01)，并随染毒剂量增加而升高(图1)。

图1 染铅小鼠睾丸组织铅浓度(ng/g)Fig 1 Concentration of Pb in the testis of mice exposed to Pb

2.2 醋酸铅对精子质量的影响

如表1所示，亚慢性染铅组小鼠精子的密度和存活率显著低于对照组(P＜0.01)，而染铅组小鼠精子的畸形率显著高于对照组(P＜0.01)，其中1.5 g/L染铅组小鼠精子的密度和存活率降低和畸形率增高最为明显。如表2所示，亚慢性染铅组小鼠精子的活动度显著低于对照组(P＜0.01)。即染铅组小鼠的慢或呆滞的前向运动或不动的精子数显著增多，而快速前向运动的精子数显著少于对照组。尤其1.5 g/L染铅组小鼠精子的活动度降低最为明显。

2.3 小鼠睾丸铅蓄积与精子质量降低之间的关联性

如图2所示，醋酸铅暴露小鼠睾丸铅浓度与精子活动率之间呈显著正相关(P＜0.0001)，其回归方程为y= -0.14x+95.16。而醋酸铅暴露小鼠睾丸铅浓度与精子的密度、活力和存活率之间呈显著负相关(P＜0.0001)，其回归方程分别为 y=-0.012x+4.98、y= - 0.14x+95.16 和 y=-0.13x+97.49。

表1 醋酸铅暴露小鼠精子的密度、存活率和畸形率Tab 1 Density and survival，and malformation rate of Sperm in testes of mice exposed to Pb acetate (±s)

表1 醋酸铅暴露小鼠精子的密度、存活率和畸形率Tab 1 Density and survival，and malformation rate of Sperm in testes of mice exposed to Pb acetate (±s)

1)与对照组比较，P＜0.01;2)与0.5 g/L 组比较，P ＜0.01;3)与1.0 g/L 组比较，P ＜0.01#:血球计数板中间方格精子数×106mL;*:每个样本计数1000个精子

组别 精子密度(数目 ×106/mL，n=15)#精子存活率(%，n=15)*精子畸形率(%，n=15)*96.6 ±0.80 7.0 ±0.01 0.5 g/L 4.16 ×106 ±0.231) 90.5 ±0.551) 15.2 ±0.03 1.0 g/L 3.26 ×106 ±0.481)2) 81.1 ±0.801)2) 32.8 ±0.051)2)1.5 g/L 2.91 ×106 ±0.281)2) 71.4 ±0.491)2)3) 35.8 ±0.021)2)对照组 5.19×106±0.46

表2 醋酸铅暴露小鼠精子活力Tab 2 Sperm activity in testis of mice exposed to Pb acetate (±s)

表2 醋酸铅暴露小鼠精子活力Tab 2 Sperm activity in testis of mice exposed to Pb acetate (±s)

1)与对照组比较，P＜0.01;2)与0.5 g/L 组比较，P ＜0.01;3)与1.0 g/L 组比较，P ＜0.01

组别 WHO 精子活动度分级 精子活动度(%，n=15)I II III IV (I+II+III)/(I+II+III+IV)55 ±1.3 19 ±1.6 21 ±1.9 6 ±1.6 94.1 ±1.6 0.5 g/L 47 ±1.4 21 ±0.6 21 ±1.9 13 ±2.41) 87.3 ±1.61)1.0 g/L 43 ±0.81)2) 19 ±0.8 18 ±0.8 21 ±3.51)2) 79.2 ±1.51)2)1.5 g/L 37 ±0.71)2)3) 16 ±1.21)2)3) 16 ±1.11) 32 ±1.51)2)3) 68.3 ±1.11)2)3)对照组

3 讨 论

流行病学调查和动物实验研究均显示，铅暴露对精子的发育、成熟均具有明显的抑制作用。Telisman等［4］对101名接触铅工人进行调查，发现血铅与精液量、精子密度、精子活力和精子活率呈明显负相关。Cullen等［5］对7名临床诊断为铅中毒患者的精液检查发现，包括2名少精液症和2名无精子症在内，有5名患者在精子发生、发育方面存在缺陷，但血中T和催乳素等激素水平均无明显变化。Wadi等［6］用含不同浓度铅的饮水饲养雄性成熟小鼠6周，结果显示铅暴露组附睾内精子数量明显减少，精子数量和活动精子所占比例降低。本实验结果表明，亚慢性染铅组小鼠精子的密度和存活率及活动度显著低于对照组，尤其高剂量染铅组小鼠的精子中不动的精子数量明显增多。另外，染铅组小鼠精子的畸形率显著高于对照组，并呈现明显的剂量反应关系，与上述文献的结果一致。然而，铅暴露对精子的发生、发育的毒作用机制并不十分清楚。

图2 醋酸铅暴露小鼠睾丸铅蓄积与精子质量降低之间的相关性分析Fig 2 Correlation analysis between testicular lead accumulation and the decreased sperm quality in mice exposed to Pb acetate

睾丸组织与流经睾丸的血液之间有一个防护层，称为血睾屏障 (blood-testis barrier)。一般认为，该屏障具有阻止有害物质通过和防止生殖细胞损伤等重要生理功能。本实验结果显示铅暴露组小鼠睾丸组织铅浓度显著高于对照组，并随染毒剂量增加而升高。而且，铅暴露小鼠睾丸铅浓度与精子的活动率、密度和存活率之间呈显著负相关。Naha等［7］报道，接触铅工人精液中铅浓度明显升高。Telisman等［8］也报道，接触铅工人精液中的铅浓度与精子的密度和活力呈显著负相关，与本实验结果一致。本研究结果提示，亚慢性铅暴露小鼠可导致小鼠睾丸组织铅蓄积。而且，铅在睾丸组织蓄积可能是亚慢性暴露小鼠精子质量下降的重要因素。今后有必要进一步深入研究两者之间的密切关联性。

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Effect of subchronic exposure to lead on sperm quality of mice and accumulation of lead in the testis

JIN He-tian1，WANG Xiao-xu2，PIAO Feng-yuan2
(1.Centre of Radiotherapy，the202Hospital of Shenyang，Shenyang110000，China;2.Department of Occupational and Environmental Health，College of Public Health，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo observe effect of subchronic exposure to lead(Pb)on sperm quality of mice and accumulation of Pb in the testis.MethodsSixty mice were divided into 4 groups of 15 each.Group 1 received drinking water alone(control).Group 2，3 and 4 received 0.5，1.0 and 1.5 g/L Pb acetate respectively.Pb acetate was given through drinking water.On the 60th day after Pb exposure，mice were decapitated and the epididymis and testis were taken.After the treatment，the concentration of Pb was determined in testis of mice by inductively coupled plasma-mass spectrometry(ICPMS)and the sperm quality was observed by microscope.The correlation between concentration of Pb in testis and toxic effect of it on the sperm quality was also analyzed by Linear regression analysis.ResultsThe activity of sperm in mice was 9.73 ng/g in control group and 87.3%，79.2%，and 68.3%respectively in the 0.5，1.0 and 1.5 g/L Pb acetate groups.The activity of sperm was significantly lower in the experimental groups than that in controls(P＜0.05).The sperm malformation rate was 15.2%，32.8%and 35.5%in the groups exposed to Pb and significantly increased compared with control group(7.0%)(P＜0.05).Concentration of Pb in the testis was 72.71，118.74，and 177.14 ng/g respectively in the 3 experimental groups and significantly higher than that in control group(9.73 ng/g)(P＜0.05).Moreover，there was significant negative correlation between the Pb concentration in testis and density，survival rate，and viability of sperm in mice exposed to Pb.ConclusionThe subchronic exposure to Pb can induce the accumulation of Pb in the testis of mice.It indicates that the accumulated Pb in testis may be responsible for the decreased sperm quality in mice exposed to Pb.

［Key words］lead acetate;male reproductive toxicity;lead accumulation;sperm quality

R114

A

1671-7295(2013)02-0108-04

金河田，王晓旭，朴丰源.亚慢性铅暴露小鼠睾丸组织铅蓄积及对精子质量影响［J］.大连医科大学学报，2013，35(2):108 -111.

10.11724/jdmu.2013.02.02

国家自然科学基金(81172719)

金河田(1960-)，男，辽宁沈阳人，副主任医师。

朴丰源，教授，博士生导师。E-mail:piaofy_dy@yahoo.com.cn

2013-01-09;

2013-03-15)