温和碱氧化处理对花生壳酶解效果的影响

刘朝龙 王雨生，2 陈海华

(青岛农业大学食品科学与工程学院1，青岛 266109)

(青岛农业大学学报编辑部2，青岛 266109)

我国是花生的生产大国，年产花生约12 000 kt，其中花生壳约占花生果重的30%［1］，花生壳中含有65%～80%的粗纤维［2］。因其纤维素结构中有复杂的无定形区、结晶区和微纤维［3］，尤其是结晶区不存在游离的羟基，因此要高效利用花生壳中的纤维素就必须破坏花生壳纤维素的结晶结构，使纤维素易被酶解。目前，主要以物理法、化学法、生物法、联合预处理等4大类方法对纤维素原料进行预处理［4］。单一的预处理方法通常存在较多的缺点，因而多因素联合预处理方法的研究成为近年来的研究热点［5－6］。其中，温和碱氧化法是一种新兴的多因素联合预处理方法。它同时使用NaOH和H2O2，可有效去除纤维原料中的半纤维素和木质素，释放纤维素，提高纤维素的酶解效果［7－8］。目前尽管已有关于温和碱氧化试剂回收及循环利用的专利［9］，但是国内采用温和碱氧化法处理纤维素原料的研究报道比较少见。姚秀清等［10］利用温和碱氧化法处理脱蜡的秸秆样品，对总糖回收率和木质素去除率作了回归分析，并最终确定了优化条件。王洋等［11］采用超声波辅助温和碱氧化法对小麦秸秆进行预处理，建立了各试验因素与处理后木质素相对含量关系的数学模型。目前尚未见到关于温和碱氧化处理花生壳的研究报道。

我国每年有大量花生壳被废弃，造成极大的资源浪费。若能采用温和碱氧化法对其进行适当处理后酶解，可制得还原糖液，为后续发酵生产乙醇或生产热反应香精提供原料，变废为宝。

本试验主要采用温和碱氧化法(NaOH－H2O2)对花生壳进行预处理，并对温和碱氧化法的作用条件进行优化，以期为花生壳纤维素的预处理方法提供理论依据，并为后续花生壳纤维素的酶解做好准备。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生壳、纤维素酶(2×104U/g):康地恩生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 试验设备

DELTA320pH计:梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;DHG－9070A型电热鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;紫外/可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 温和碱氧化处理工艺条件的单因素试验

先将花生壳清洗3次，除去杂质，在105℃下的干燥箱内烘干，粉碎、过80目筛。称取一定质量经清洗、除杂过的花生壳粉末，分别经下述处理后，冷却，3 000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀洗涤至中性后于105℃下的干燥箱内烘干，粉碎、过100目筛，密封保存，留待酶解。

NaOH质量分数对预处理效果的影响:按液固比15∶1加入质量浓度分别为2～10 g/100 mL的NaOH溶液，在40℃水浴中搅拌处理2.0 h。

H2O2体积分数对预处理效果的影响:按液固比15∶1加入体积分数分别为1% ～5%的H2O2溶液，在40℃水浴中搅拌处理2.0 h。

VNaOH与VH2O2比例对预处理效果的影响:按液固比 15∶1 加入 VNaOH:VH2O2分别为 9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1的NaOH－H2O2混合溶液，在40℃水浴中搅拌处理 2.0 h。

液固比对预处理效果的影响:分别按液固比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 加入 VNaOH:VH2O2为 5∶1的NaOH－H2O2混合溶液，在40℃水浴中搅拌处理2.0 h。

预处理温度对预处理效果的影响:按液固比15∶1加入 VNaOH:VH2O2为 5∶1 的 NaOH － H2O2混合溶液，分别在 40、50、60、70、80 ℃ 水浴中搅拌处理2.0 h。

预处理时间对预处理效果的影响:按液固比15∶1加入 VNaOH:VH2O2为 5∶1 的 NaOH － H2O2混合溶液，在50℃水浴中分别搅拌处理2.0～10.0 h。

1.3.2 温和碱氧化处理工艺条件的响应面试验

响应面试验的设计:基于单因素试验所初步确定的温和碱氧化处理的单因素条件，采用响应面法在3因素、3水平上对温和碱氧化条件进行优化，试验设计的因素及水平设计见表1。

表1 响应面优化因素与水平

1.3.3 传统酸法或碱法对花生壳纤维素的预处理

称取一定质量经清洗、除杂的花生壳粉末，按液固比15∶1，经体积分数为1%的HCl溶液在60℃水浴中搅拌处理1.0 h，或者经质量浓度为8 g/100 mL的NaOH溶液在40℃水浴中搅拌处理1.0 h后，冷却，3 000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀洗涤至中性后于105℃下的干燥箱内烘干，粉碎、过100目筛，密封保存，留待酶解。

1.3.4 花生壳的酶解

称取一定质量预处理后的花生壳粉，加入一定体积的蒸馏水，使液固比为15∶1，调节至pH 4.5，加入一定量的体积分数为1%的纤维素酶，搅拌均匀，在50℃下酶解6.0 h，酶解结束后，进行沸水浴灭酶20 min，使酶失活，自然冷却，3 000 r/min离心20 min，所得上清液即花生壳酶解液。

1.3.5 酶解液还原糖含量的测定

采用DNS法［12］测定酶解液中的还原糖含量。

1.3.6 酶解率的测定

酶解率(简称DH)，是指酶解液中还原糖总量占酶解前样品中纤维素总量的百分比，按如下公式计算:

1.4 数据处理

利用Design Expert 8.05b软件的多元线性回归分析程序对试验结果进行处理。

2 结果与分析

2.1 温和碱氧化单因素条件对预处理效果的影响

2.1.1 NaOH质量浓度对预处理效果的影响

由图1可以看出，随NaOH质量浓度的升高，花生壳纤维素酶解率显著增加，当NaOH质量浓度超过8 g/100 mL后，酶解率增加缓慢。这可能是因为当NaOH质量浓度增大到一定水平时，NaOH对纤维素的润胀作用接近极限，因而酶解率增加缓慢。综合考虑，温和碱氧化处理花生壳时适宜的NaOH质量浓度为8 g/100 mL。

图1 NaOH质量浓度对花生壳酶解率的影响

2.1.2 H2O2体积分数对预处理效果的影响

由图2可知，随着H2O2体积分数的升高，花生壳酶解率呈现先上升后下降的趋势，H2O2体积分数为4%，花生壳的酶解率达到最大值。这可能是因为H2O2体积分数在一定范围内，能充分氧化木质素及其降解所产生的酚类物质，释放更多的纤维素，有利于纤维素酶解反应［8］;当H2O2体积分数超过一定限度，可能导致部分纤维素氧化破坏，酶解率降低［7］。综合考虑，温和碱氧化处理花生壳时适宜的H2O2体积分数为4%。

图2 H2O2体积分数对花生壳酶解率的影响

2.1.3 VNaOH与 VH2O2比例对预处理效果的影响

由图3可知，随着VNaOH与VH2O2比例的减小，花生壳酶解率呈现先上升后下降的趋势，当VNaOH与VH2O2比例为5∶1时，花生壳的酶解率达到最大值。当VNaOH与VH2O2比例在一定范围内，NaOH的润胀作用占据优势，有利于纤维素的释放，促进纤维素的酶解;但是，当VNaOH与VH2O2比例的降低至某一范围后，NaOH对纤维素的润胀作用逐渐不明显，H2O2作用的有限性越来越明显，导致花生壳纤维素酶解率降低。综合考虑，温和碱氧化处理花生壳时适宜的VNaOH与VH2O2比例为 5∶1。

图3 VNaOH与VH2O2比例对花生壳酶解率的影响

2.1.4 液固比对预处理效果的影响

由图4可知，在一定范围内，随着液固比的升高，花生壳酶解率呈现先上升后下降的趋势，液固比为15∶1时酶解率达到最大值，超过25∶1后，酶解率反而会降低。综合考虑，温和碱氧化处理花生壳时适宜的液固比为15∶1。

图4 液固比对花生壳酶解率的影响

2.1.5 预处理温度对预处理效果的影响

由图5可知，在一定范围内，随着预处理温度的升高，花生壳酶解率呈现先上升后下降的趋势。当温度在一定范围内(低于50℃)升高时，由于分子运动程度加剧，使得NaOH与H2O2对花生壳纤维素的预处理效果增强;但是，随着温度的继续升高，H2O2分解速率加快，使其作用减弱，因而预处理效果变差。在本试验中，当预处理温度为50℃时花生壳纤维素的酶解率最高，所以温和碱氧化处理花生壳时的适宜温度为50℃。

图5 预处理温度对酶解率的影响

2.1.6 预处理时间对预处理效果的影响

由图6可知，随预处理时间的延长，花生壳酶解率呈现微弱的先上升后下降的趋势。这可能是由于最初随着预处理时间的延长，增加了NaOH、H2O2与木质素半纤维素的作用时间，两者与木质素半纤维素充分接触，提高了预处理效果，利于花生壳纤维素的酶解;但是随着预处理时间的继续延长，由于H2O2自身分解，其预处理效果减弱，使得花生壳纤维素酶解率降低［13］。当预处理时间为2.0 h时，花生壳纤维素的酶解率达到27.57%，在2.0 h以后，预处理时间对预处理效果的提高并不明显。考虑到经济成本，选择花生壳温和碱氧化处理的适宜时间为2.0 h。

图6 预处理时间对花生壳酶解率的影响

2.2 预处理条件的响应面优化分析

响应面优化试验方案及结果见表2。

表2 响应面优化试验方案及结果

由表3中回归模型及方差分析结果可知，此模型的P＜0.01，回归模型达到极显著水平。其中，X1、X2、X1X2、X1X3、X12、X22、X327 项 P ＜ 0.01，它们对响应值Y的影响极显著，其余项对Y不构成显著影响。失拟项各项数据表明该模型失拟不显著，说明该回归方程能较好的拟合真实的响应面［14］。相关系数R2=0.992 7，说明该回归方程拟合情况非常好，能够解释绝大多数因变量变化。

根据试验结果，用Design Expert 8.05b软件对试验数据进行回归分析，得出酶解率与各因子之间的二次线性回归方程为:

Y=27.41+0.556X1+2.624 X2+0.398 X3－1.243X1X2－1.145 X1X3+0.135 X2X3－1.146X12－1.88X22－1.214 X32

通过比较回归方程一次项系数绝对值的大小，可以判断各因子对花生壳纤维素酶解率影响的主次性［15－17］，即花生壳预处理的过程中，处理温度对花生壳纤维素酶解率的影响最大，其次是处理时间，最后是 VNaOH∶VH2O2。

表3 回归模型方差分析表

图7 VNaOH∶VH2O2与预处理温度对酶解率影响的响应曲面和等高线图

交互因素对花生壳纤维素酶解率影响的响应曲面和等高线图如图7～图9所示。由回归方程的偏回归系数显著性检验、交互因素的响应曲面和等高线图可知各因素之间的交互作用［18］，即X1(VNaOH∶VH2O2)与 X2(处理温度/℃)之间以及 X1(VNaOH∶VH2O2)与X3(处理时间/h)存在极显著的交互效应(P12=0.000 1 ＜0.01，P13=0.000 2 ＜0.01)。

经响应面分析得出花生壳预处理的最佳工艺条件为:VNaOH∶VH2O2为 4.6∶1，处理温度 58 ℃，处理时间2.2 h，预测的花生壳纤维素的酶解率为28.50%。在上述试验条件下进行验证试验，得到的花生壳纤维素的酶解率为28.48%，与计算机模拟值基本接近，表明预测值和真实值之间有很好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。

2.3 温和碱氧化法与传统预处理方法效果的比较

温和碱氧化法与传统预处理方法对花生壳纤维素预处理效果的比较如表4所示。

表4 温和碱氧化法与传统预处理方法对花生壳纤维素酶解率的影响

由表4可知，温和碱氧化法远优于传统的酸/碱预处理方法，可以明显提高花生壳纤维素的酶解率，进而提高花生壳纤维素的利用率。

3 讨论与结论

本试验以花生壳为原料，采用温和碱氧化法(NaOH－H2O2)对其进行预处理，为后续酶解花生壳纤维素做准备。结果表明，花生壳温和碱氧化处理的最佳工艺条件为:VNaOH∶VH2O2为 4.6∶1，处理温度58℃，处理时间2.2 h。在此预处理条件下花生壳纤维素的酶解率可达28.48%，远高于经传统的酸/碱预处理后花生壳纤维素的酶解率。各因素的影响主次顺序为:处理温度＞处理时间＞VNaOH∶VH2O2。

本研究突破了传统方法对花生壳进行了预处理，而不再只局限于对稻壳、秸秆等纤维素原料的研究。采用远优于传统的酸/碱预处理方法的温和碱氧化法(NaOH－H2O2)对花生壳进行预处理，明显提高了花生壳纤维素的酶解率，真正变废为宝。但是，本研究中温和碱氧化法的氧化剂并未经过细致全面的筛选，过氧化氢是否优于过氧乙酸等其他氧化剂有待进一步探索。另外，本研究只是将温和碱氧化法与传统酸/碱预处理方法进行了比较，至于其能否与微波、超声波等物理方法相结合及结合后预处理效果如何还有待进一步研究。

本试验研究了温和碱氧化法对花生壳进行预处理的效果及条件优化，为实现花生壳的再利用提供理论依据，并为工业上预处理花生壳提供参考。

［1］杨伟强，秦晓春，张吉民，等.花生壳在食品工业中的综合开发与利用［J］.花生学报，2003，32(1):33－35

［2］孙丰文，张茜，李自峰.花生壳综合利用的研究进展［J］.山东林业科技，2008，38(6):84 －88

［3］朱跃钊，卢定强，万红贵，等.木质纤维素预处理技术研究进展［J］.生物加工过程，2004，2(4):11 －16

［4］赵律，李志光，李辉勇，等.木质纤维素预处理技术研究进展［J］.化学与生物工程，2007，24(5):5 －8

［5］文新亚，李燕松，张志鹏，等.酶解木质纤维素的预处理技术研究进展［J］.酿酒科技，2006(8):97－100

［6］岳建芝，李刚，张全国.促进木质纤维素类生物质酶解的预处理技术综述［J］.江苏农业科学，2011，39(3):340 －343

［7］钟文文.秸秆预处理对纤维素酶水解效果的影响［J］.湖北农业科学，2007，46(6):1006 －1008

［8］余君.不同预处理工艺对稻壳纤维素酶酶解效果的影响［D］.武汉:华中农业大学，2008

［9］清华大学.植物纤维原料温和碱/氧化法预处理及溶剂循环利用工艺:中国，101003955［P］.2007－07－25

［10］姚秀清，张全，杨祥华，等.碱性双氧水法预处理木质纤维素［J］.化学与生物工程，2009，26(3):34 －37

［11］王洋，王振斌，王世清，等.超声波辅助温和碱/氧化法进行小麦秸秆预处理的方法［J］.江苏农业学报，2010，26(2):308－314

［12］赵凯，许鹏举，谷广烨.3，5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究［J］.食品科学，2008，29(8):534－536

［13］竺际舜.无机化学［M］.北京:科学出版社，2008:279－282

［14］彭勇胜，王江之，黄程，等.响应面法优化姬松茸多糖的提取工艺［J］.现代食品科技，2011，27(9):1119 －1122

［15］章平，陈树琳，秦军，等.氨基酸和还原糖类反应的研究［J］.贵州工业大学学报:自然科学版，1996，25(4):90－93

［16］陈海华，李国强.响应面分析法优化酶法提取谷朊粉工艺的研究［J］.中国粮油学报，2010，25(12):106 －110

［17］陈海华，鲁军.响应曲面法优化狭鳕鱼皮明胶的微波辅助提取工艺［J］.食品与发酵工业，2009，35(8):168－174

［18］黄相印.响应面分析法优化增强型海藻纤维的制备工艺［D］.济南:山东轻工业学院，2011.