小麦胚芽水溶性提取物的体外抗乳腺癌活性研究

朱科学 连彩霞 郭晓娜 周惠明

(江南大学食品学院，无锡 214122)

小麦胚芽是小麦干法加工的主要副产物之一，含有丰富的蛋白质和油脂，并且含有多种生理活性成分，是不可多得的天然优质食品资源［1］。近年来，有较多的研究表明小麦胚芽具有抗氧化［2］、抗高血压［3］、增强免疫力［4－5］和抗疲劳［6］等多种生理活性。然而近年来，随着对小麦胚芽研究的深入，其提取物的抗肿瘤活性得到了越来越多研究者的关注［7－8］。开发以小麦胚芽提取物为抗肿瘤功效成分的健康食品，具有无毒安全营养的特点，对深度开发和综合利用小麦胚芽资源具有较好的现实意义。本试验通过体外细胞的方法，研究小麦胚芽水溶性提取物的对乳腺癌细胞(MDA－MB231)增殖活性、生长曲线和细胞形态的影响，为小麦胚芽水溶性提取物作为抗肿瘤食品配料提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜的小麦胚芽由淮安新丰面粉有限公司提供;MDA－MB231细胞:中国科学院上海生命科学研究院细胞资源;RPMI 1640培养基:美国GIBCO公司;青霉素、链霉素为医用级;胰酶:华美生物工程有限公司;Hoechst 33242染色液:碧云天生物技术研究所;新生牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

DFY－600摇摆式高速中药粉碎机:温岭市林大机械有限公司;RE－52A旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;UV－2800型紫外可见分光光度计:尤尼柯上海仪器制造公司;5804R高速冷冻离心机:德国艾本德公司;超低温冷冻冰箱:美国INVETRO公司;Multiskan Mk3酶标仪:美国Thermo公司;倒置显微镜:OLYMPUS BX51;扫描电子显微镜:荷兰FEI公司;96孔细胞培养板:美国Costar公司;CO2培养箱:Thermo Forma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 脱脂麦胚粉及水溶性提取物的制备

除杂后的新鲜小麦胚芽加入正己烷浸泡脱脂，间隔2 h更换一次正己烷，直至滴在滤纸上的上清液风干后无油印为止。将脱脂后的麦胚风干后过筛(60目)除去附着的细粉，经摇摆式高速中药粉碎机粉碎过筛(100目)得到细粉即为脱脂麦胚粉。

将脱脂麦胚粉和去离子水以液料比10:1混合;搅拌提取3 h，然后低温离心(10 000 r/min，4℃，20 min)得到上清液，将残渣再用去离子水提取1 h，相同条件下离心，将两次得到的上清液进行冷冻干燥后即得水溶性提取物。

水溶性提取物的蛋白质含量测定采用微量凯氏定氮法测定(N×6.25);总糖含量采用苯酚硫酸法测定;总酚含量采用Folin－Ciocalteu试剂测定。

1.3.2 细胞培养

将人源乳腺癌细胞MDA－MB231细胞培养于含有10%小牛血清，100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素，以及2 mmol/L谷氨酸盐的 RPMI1640完全培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。MDA－MB231细胞在细胞瓶里呈单层生长，每3天以0.25%胰酶消化传代一次，取对数生长期的细胞进行试验［9］。

1.3.3 MTT法测定提取物抑制MDA－MB231细胞增殖活性

0.25%胰酶消化得到的对数生长期细胞，台盼蓝染色计数，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×104个/mL，将100μL细胞加入96孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，再加入含有提取物的RPMI1640完全培养基100μL，空白对照组为加入等体积的正常的RPMI1640完全培养基，每组浓度设6个复孔，将细胞培养板移入CO2培养箱中，在37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养24、48、72 h。

培养结束后，吸去培养液，每孔加入100μL MTT溶液(0.5 mg/mL)，继续在37 ℃，5%CO2培养箱中培养4 h，彻底除去上清液，每孔加入150μL二甲亚砜(DMSO)，在37℃下培养20 min后，在570 nm处测定各孔的吸光度，每个试验重复4次，计算抑制率［9］。

1.3.4 小麦胚芽水溶性提取物对细胞生长曲线的影响

采用MTT比色法计数测定［10］:取对数生长期的MDA－MB231细胞，经0.25%胰酶消化后，用 RPMI1640完全培养基调整细胞浓度1×107个/mL，将细胞浓度倍比稀释至1×102个/mL，每个稀释度六孔细胞，培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养4 h后细胞贴壁，吸走培养液，每孔中加入100μL MTT(0.5 mg/mL)继续培养4 h，然后吸出上清液，加入150μL DMSO，37℃下保温20 min，在570 nm处测定吸光度，根据吸光度和细胞浓度绘出标准曲线，每个试验重复3次。

参照方法1.3.3，将得到的吸光度在标准曲线上计算出相应的细胞数，即可绘出细胞的生长曲线。

1.3.5 小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞的生长状况影响

取对数生长期MDA－MB231细胞，用RPMI1640完全培养基调整细胞浓度至1×105个/mL，加入细胞培养瓶中。正常培养基培养24 h后，然后加入含有小麦胚芽水溶性提取物的RPMI1640完全培养基使培养基里提取物的最终浓度为750、1 000、1 500 μg/mL，在37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养24、48、72 h，在倒置显微镜下观察细胞培养瓶中细胞的生长状态［11］。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 小麦胚芽水溶性提取物的提取及组成

原料是脱脂麦胚粉，其水溶性提取物的提取率达到48.03%。水溶性提取物中蛋白质质量分数为38.47%，总糖含量为 48.11%，总酚含量为14.63 mgGAE/g。

2.2 小麦胚芽水溶性提取物对乳腺癌(MDAMB231)细胞生长增殖抑制率

MTT法是目前美国国立肿瘤所推行的抗癌药物体外筛选的有效方法，该法测定活细胞数目及细胞增殖能力，操作简单，试验周期短，所需细胞数少，而且无放射性污染，其检测结果与同位素渗入法有良好的一致性，适用于体外大规模筛选。MTT的四氮唑环在线粒体脱氢酶作用下生成蓝紫色的甲臜，甲臜在最大吸收波长570 nm处吸光度值与其形成量有关。只有活细胞内才形成甲臜，死细胞无此功能，所以570 nm处吸光度值与活细胞数成正比，以此鉴别活死细胞。

从图1可以看出，小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞增殖有显著抑制作用，并且呈现剂量效应。提取物浓度为1 500μg/mL时，水溶性提取物作用48和72 h后的抑制率分别达到80.84%和90.05%。小麦胚芽水溶性提取物作用24、48和72 h后其IC50值分别为1 751、721和650μg/mL，说明小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞增殖具有明显的抑制作用，呈现一定的剂量效应，并且随着提取物对MDA－MB231细胞作用时间的延长，提取物的抑制率均有所上升。

图1 小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞增殖抑制作用

2.3 小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231生长曲线的影响

细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。消化传代后的细胞经过短暂的悬浮然后贴壁，渡过一定时间的潜伏期，随即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，进而退化衰亡。

图2 小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞生长曲线的影响

生长曲线体现了MDA－MB231细胞在体外培养过程中的增殖动态变化。从图2中可以清楚地看出小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞生长曲线的影响。空白组细胞贴壁后生长迅速，细胞数随时间延长显著上升，添加500和750μg/mL小麦胚芽水溶性提取物的MDA－MB231细胞生长相对缓慢，细胞数上升缓慢。1 000和1 500μg/mL水溶性提取物作用的MDA－MB231细胞出现负增殖。随着提取物浓度的增加和培养时间的延长，MDAMB231增殖降低，甚至出现负增殖，呈现了一定的剂量效应和时间效应。

2.4 小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞形态影响

细胞的形状多种多样，有球体、多面体、纺锤体和柱状体等。细胞内在的结构、自身表面张力以及外部的机械压力不同，各种细胞总是保持自己的一定形状。当细胞所处的环境发生改变时，细胞受到影响，细胞形态也会发生不同程度的变化。在显微镜下观察细胞形态的变化也可以推断细胞生长的状况是否良好。

图3 小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞作用24 h后细胞形态的影响(×100)

从图3中可以看出，空白组正常的 MDAMB231细胞成纤维状，大小均匀，表面光滑折光性好，细胞贴壁生长正常，而小麦胚芽水溶性提取物作用后的MDA－MB231细胞细胞数有所减少，提取物抑制了MDA－MB231细胞的生长和增殖，并呈现一定的剂量效应。随着提取物浓度的增大，细胞的特征形态逐渐消失，细胞数越来越少，纤维变短，部分细胞开始簇集成团。

从图4中可以看出，正常组细胞饱满，表面光滑，折光性好，而小麦胚芽水溶性提取物作用48h的细胞细胞数量明显减少，形态变化较大，细胞皱缩变小，与周围的细胞脱离，大量细胞簇集成团，培养液里漂浮死细胞。

图4 脱脂麦胚水提物对MDA－MB231细胞作用48 h后细胞形态的影响(×100)

图5 脱脂麦胚水提物对MDA－MB231细胞作用72 h后细胞形态的影响(×100)

从图5中可以看出，空白组正常细胞成纤维状，细胞贴壁生长排列紧密，相互连接粘附。小麦胚芽水溶性提取物作用72 h MDA－MB231细胞，细胞贴壁异常，纤维状特征逐渐消失，细胞变圆，细胞大小差异增大，大量细胞死亡脱落，漂浮在培养液中。高浓度的提取物作用细胞细胞数很少，细胞完全没有细胞特征形态。

不同浓度的小麦胚芽水溶性提取物作用细胞24、48和72 h后，将培养瓶置于倒置显微镜下观察到细胞形态显示:提取物对细胞的细胞数和细胞形态都有所影响，提取物作用后的细胞数目变少，细胞形态明显变化，培养液里漂浮有死细胞，小麦胚芽水溶性提取物对MDA－MB231细胞的生长增殖有很好的抑制作用。

3 结论

小麦胚芽水溶性提取物对乳腺癌细胞(MDAMB231)生长增殖有显著的抑制活性，并且抑制效果呈现一定的时间效应和剂量效应。提取物作用后的细胞，细胞呈现凋亡的明显特征:细胞数明显变少，细胞开始簇集成团，贴壁异常，细胞纤维状特征形态逐渐消失，个体变圆，折光率降低，培养液里漂浮死细胞。在后续的研究中我们将对其中的功效因子进行分析鉴定，并对其作用机理进行深入探讨。

［1］Amado R，and Arigoni E.Nutritive and functional properties of wheat germ［J］.International Food Ingredients，1992，4:30 －34

［2］Krings U，El－ Saharty Y S，El－ Zeany B A.Antioxidant activity of extracts from roasted wheat germ［J］.Food Chemistry，2000，71:91 －95

［3］Matsui T，Li C.H，Tanaka T，et al.Depressor effect of wheat germ hydrolysate and its novel angiotensin I－converting enzyme inhibitory peptide，Ile － Val－ Tyr，and the metabolism in rat and human plasma［J］.Biol Pharm Bull，2000，23(4):427－31

［4］Chignola R，Rizzi C，Vincenzi S，et al.Effects of dietary wheat germ deprivation on the immune system in Wistar rats:a pilot study［J］.International Immunopharmacology，2002，2(10):1495－1501

［5］孙震，周惠明.小麦胚中水溶性和盐溶性提取物的免疫活性研究［J］.中国粮油学报，2001，16(5):29 －32

［6］于长青，王宪华，张丽萍.麦胚抗疲劳作用研究［J］.中国粮油学报，2003，18(2):33 －35

［7］Mueller，T，Voigt，W.Fermented wheat germ extract－ nutritional supplement or anticancer drug?［J］.Nutrition Journal，2011(10):89

［8］Telekes，A，Hegedus，M，Chae，C H，et al.Avemar(Wheat Germ Extract)in Cancer Prevention and Treatment［J］.Nutrition and Cancer－ an International Journal，2009，61:891 －899

［9］程宝鸾.动物细胞培养技术［M］.广州:华南理工大学出版社，2000:131－132

［10］王建华，张涛，纪宗正.应用噻唑蓝比色法进行大肠癌与胆囊癌细胞生长曲线的对比测定［J］.现代肿瘤医学，2005，13(3):310 －312

［11］Tao J，Zhang P，Liu G，et al.Cytotoxicity of Chinese motherwort(Yi Mu Cao)aqueous ethanol extract is non－apoptotic and estrogen receptor independent on human breast cancer cells［J］.Journal of Ethnopharmacology，2009，122:234 －239.