红花宏观质量参数稳定性与“虹势性”规律的研究

杜玉然， 贺福元，2*， 邓俊林， 雷 虹， 包小燕， 谢相贵

(1．湖南中医药大学药学院，湖南长沙410208;2．中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，湖南长沙410208)

中药材在自然界空气、水、无机盐、阳光等生物环境因素的影响下，经过漫长的生物进化形成了稳定的物种，具有遗传多态性［1］。其生长发育可看成为在初生、次生代谢酶体系特别是CYP450家族酶的作用下，将初生态外源性成分有序生化代谢成次生态内源性成分的综合过程。因此中药材作为多成分的有机整体其成分间具有同母核群生性的特点［2］。红花药材在全国多省份均有生产，由于地理环境因素的影响，微观状态为母核衍化的群生化合物种类及含有量不同，宏观表现为红花质量的参差不齐，这就给红花药材建立完整质量控制方法提出了难题。

本课题组已提出的“网通虹势”代谢规律，即药材同母核群生性成分间代谢“网通”［3］，可以相互转化，另外根据生物物理学原理，中药材生长发育遵循热力学守恒定律，成分间化学势整体维持平衡如虹吸现象 (此消彼长，总量不变)［4］。本研究以“网通虹势”为原理依据，针对不同产地红花药材，以生物热力学为理论依据，创立红花药材的热力学状态函数，研究红花宏观状态参数与虹势性规律的关系，为构建宏观状态函数与微观成分浓度相统一的中药化学质量控制体系提供模型及数据参考［5］。

1 原理

本课题组提出中药材的多态性与成分的多样性可用遗传统计学与理论生物物理学进行研究，建立起微观成分指纹图谱信息与宏观状态函数数学模型［6］。中药材成分宏观质量参数体系包括表观平衡常数、燃烧焓、信息熵、信息量、生物熵，其中燃烧焓、信息熵、生物熵及表观平衡常数反映中药材不同遗传状态的性质参数，而信息量反映其量变的程度参数。公式推导详见本课题组文献［7］，应用公式列举如下:在初生态环境稳定的条件下，表观平衡常数K'为K'=，式中ai为次生态i成分浓度，初生态s成分浓度。信息熵Sie为Sie=其中C为常数。信息量Siq为Siq为特征峰的总面积，W0为对应的总质量。生物熵

2 实验材料及方法

2.1 仪器与试药

2.1.1 仪器 电子天平CP114(上海奥豪斯仪器有限公司)，SK2200HP型数控超声仪 (上海科导超声仪器有限公司)，HH—4智能数显恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)，DRF—6050型真空干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司);安捷伦高效液相色谱仪，Agilent 1200色谱分析工作站，Agilent UV检测器，Agilent自动进样器。

2.1.2 试药 羟基红花黄色素A对照品购自中国药品生物制品检定所 (批号111637～200905，供含量测定用，规格20 mg)。13份不同产地红花药材分别来自S1四川、S2内蒙古、S3江西、S4云南、S5浙江、S6安徽、S7吉林、S8山西、S9河北、S10广西、S11新疆、S12河南、S13西藏，经湖南中医药大学药学院周日宝老师鉴定为菊科Carthamus tinctorius L．的干燥花。用60℃真空干燥箱干燥，备用。超纯水 (实验室自制)，乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2.2 红花水溶性浸出物指纹图谱的建立［8］参考2010年版《中国药典》一部附录ⅩA记载水溶性浸出物冷浸法测定。

2.2.1 羟基红花黄色素A对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品适量制备成0.625 mg/mL的溶液，加入超纯水超声溶解，定容至2 mL量瓶，即为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 分别称取不同省份的红花供试药材10 g分别置于13个500 mL三角锥形烧瓶中，分别量取250 mL蒸馏水浸润30 min，85℃水浴浸提30 min，趁热抽滤，再分别加入250 mL蒸馏水85℃水浴浸提30 min，抽滤，合并两次滤液，得到13份不同产地红花水提液。分别取2 mL不同产地的红花水提液，用0.45μm微孔滤膜过滤至自动进样瓶，供测定指纹图谱使用。其他水提液分别水浴浓缩，真空干燥，得13份干燥样品，供测定燃烧焓使用。

2.2.3 色谱条件 UtimateTM AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5μm);柱温30℃;流动相为0.2%磷酸-乙腈梯度洗脱，0 min(97∶3)→12 min(90∶10)→32 min(84∶16)→62 min(73∶27)→70 min(97∶3);体积流量1 mL/min(12 min为0.8 mL/min);进样量10μL。检测条件:Agilent 1200高效液相色谱仪 (包括G1311A四元泵、G1314B可变波长检测器、G1329A自动控温的自动进样器、Agilent LC色谱工作站)。

图1 红花水提物HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint of water extracts from Carthamus tinctorius

2.2.4 系统适应性试验 按上述色谱条件对供试品溶液、对照品溶液以及超纯水空白液进行测定，记录色谱图，如图1。理论塔板数按羟基红花黄色素计算均不低于3 000，分离度均大于1.0。阴性对照品图中无干扰峰存在。在0.125～12.5μg内呈良好的线性关系，仪器的精密度良好，样品在30℃条件下24 h基本稳定，样品制备方法具有可重复操作性。

2.2.5 全国13产地指纹图谱的建立 按上述色谱条件对各样品进针，得到指纹图谱，见图2。

图2 全国13产地红花水提物HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint chromatogram of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

2.3 燃烧焓的测定［9］在测量仪器的内筒中准确加入3 000 mL蒸馏水。精密称取标准物苯甲酸2片 (共1.001 6 g)置于燃烧皿中，将燃烧皿放于氧弹中，取约6 cm长镍铬丝安装好 (注意镍铬丝不能与燃烧皿接触可与药物接触)，拧紧氧弹。在3.0 MPa下向氧弹中充入足够氧气，安装好电极，置于内筒蒸馏水中，检查无漏气后，放好桶盖点火，开始记录显示器上温度的变化 (温度上升)，待温度首次下降为终点停止记录。终点完成时仔细观察弹筒和燃烧皿无残留，保证燃烧完全［10］。若有不完全迹象，称出未燃烧完的镍铬丝质量，经温度矫正计算标准热容量 (详细参考HR3000数显热量计使用说明)。同样方法连续测定3次，计算得标准热容量为140 561.267 1 J/K，温度升高相对标准差 (relative standard deviation，RSD)小于2.00%，说明仪器精密度好。药物提取物预先干燥，准确称定1.0 g于燃烧皿中，具体操作方法同标准苯甲酸热焓测定，计算公式如下:

上述公式中ΔT、T校正均为温度，单位为℃，ΔT试验中测得，T校正按0.005 3计算，Q点火丝按120 J计算，M为实验所称量样品质量，单位为g。

3 结果及数据分析

3.1 红花水提物的燃烧焓 按2.3项测得温度差，代入公式求得，见表1。

表1 全国13产地红花水提物燃烧焓Tab.1 Combustion enthalpies of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

由表1可知，全国13产地购置的红花水提物的燃烧焓均在－14 861与－16 006 J/g范围内，其RSD为2.235%，说明13产地红花水提物燃烧焓稳定，在能量守恒定律基础上，各地红花宏观生物热基本一致。

3.2 全国13产地红花水提物样品液指纹图谱数据分析

3.2.1 全国13产地红花指纹图谱总量统计矩参数［11］参考本课题组原积分条件［8］，最小半峰宽0.20 min、最小峰面积15 000μV/s、最小峰高1 000μV，13产地红花指纹图谱得到总量统计矩参数见表2。

表2 全国13产地红花水提物总量统计矩参数Tab.2 Total quantum statistical parameter of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

3.2.2 全国13产地红花指纹图谱相似度 按中国药典委员会推荐的中药指纹图谱相似度评价系统2004A版计算得指纹图谱的相似度，见表3。

表2与表3数据分析，总量统计矩参数及相似度可以反映不同产地红花的稳定性与差异性。总量统计矩参数是对红花指纹图谱微观信息的体现，零阶矩AUCT为指纹图谱峰面积之和，13产地AUCT的RSD为22.74%，说明不同产地红花质量存在差异性。相似度范围为0.037～0.962，其中相似度小于0.5的占38.20%，再次证明不同产地红花指纹图谱微观表征具有差异性，群体不稳定，全国13产地的红花药材质量参差不齐。

表3 全国13产地红花水提物指纹图谱相似度Tab.3 Fingerprint chromatogram's sim ilarity of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

3.2.3 全国13产地红花指纹图谱信息熵、信息量及混杂平衡常数全指纹图谱结果见表4，24特征峰成分结果见表5。

表4 全国13产地红花水提物信息熵 (量)、生物熵及表观平衡常数Tab.4 In formation entropies(capabilities)，bio-entropies and apparent equilibrium constants of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

表4～表5数据分析一，全指纹图谱信息熵范围 (3.934～5.783)，其 RSD为8.35%，24特征峰的信息熵范围 (3.316～4.373)，其 RSD为6.18%，说明全国13产地红花药材信息熵相对稳定，单位成分的混杂度小。

全指纹图谱信息量波动范围较大(7.793×107～3.195 ×108μV·s/g)，其 RSD 为 38.02%;24成分的信息量(6.569×107～1.599×108μV·s/g)，其RSD为23.56%。上述数据说明全国13产地红花水提物的信息量是不稳定的，即指纹图谱具有较高的混杂灵敏度，受到某方面影响后极易表现出信息熵的不稳定，出现较高的混杂度。故信息熵可用于生物熵的计算，而信息量不能用于生物熵［12］的计算，可用作指纹图谱的分析。

表4～表5数据分析二，全指纹图谱生物熵均在－83.46～－147.9 J/K之间，RSD为－14.36%。特征峰生物熵波动范围在－63.02与－79.8 J/K之间，其RSD为－6.208%。整体看来红花水提物的生物熵具有稳定性，宏观质量表征稳定。特征峰生物熵的稳定性优于全指纹图谱。表观平衡常数全指纹图谱算得0.033 8～0.103 4，其RSD为32.65%;24特征峰指纹图谱的表观平衡常数0.048 3～0.100 4，其RSD为21.25%。上述数据说明全国各地红花水提物的表观平衡常数不同，不同地方的气候不同，产生各成分的种类不同。

4 讨论

中药指纹图谱作为中药多成分质量控制分析体系，只能对微观成分量变进行简单描述，具有一定的局限性。因此从原植物生物学属性角度结合红花指纹图谱探讨红花各成分的动态稳定性，在原有的指纹图谱信息的基础上，转变为信息熵和信息量。再结合信息熵与平衡常数，平衡常数与Gibbs自由能的关系，建立起生物热焓、生物熵的红花多成分宏观质量控制状态函数模型，其能够全面准确地揭示红花质量动态变化规律，为中药质量控制提供参考。

表5 全国13产地红花水提物24特征峰燃烧焓、信息熵 (量)、生物熵及表观平衡常数Tab.5 Combustion enthalpies，information entropies(capabilities)，bio-entropies and apparent equilibrium constants of water extracts＇24 characteristic peaks of Carthamus tinctorius from the national 13 p rovinces

4.1 峰面积与燃烧焓方差分析 燃烧焓是红花生物能热量的宏观状态表征，指纹图谱是红花各成分群的微观含量表征。各按SPSS 16.0操作，将燃烧焓 (因变量)与24个特征峰 (自变量)经方差分析，F=11.765，P=0.002线性回归模型有统计学意义。说明各特征峰燃烧焓具有叠加性，可通过叠加计算总燃烧焓，宏观与微观具有统计学意义。

4.2 全指纹图谱与特征峰的比较 红花指纹图谱的特征峰可看做是红花主要成分群。比较表4与表5数据，可得全成分信息熵、信息量、生物熵及表观平衡常数的RSD均大于主成分群，说明主成分群的稳定性更高，且混杂灵敏度小，不易出现混杂现象。生物熵更加稳定，全国红花主成分宏观质量表征具有共通性。整体体现了全国13产地红花药材主成分的相似性，全成分的差异性。猜想不同产地红花基础药效相同，可能与主成分稳定相关;不同产地红花又有优劣之分，可能与全成分种类、含量差异有关。

综上所述，红花中药材的水提物有稳定的燃烧焓、信息熵及生物熵，宏观状态稳定。不同产地红花其指纹图谱微观表征具有差异性，多成分之间代谢体现“虹势性”，不同地方的信息量、表观平衡常数体现“道地性”。虹势性体现了药材中各成分之间的转化是控制宏观的药材代谢作用方向，道地性体现了在宏观作用下调节的精确作用。因此中药成分质量是微观各成分质量与宏观成分群组合模式质量的统一。

本实验根据遗传多态性、生物物理学燃烧焓原理，结合现有的指纹图谱质量评估方法，首次建立红花的信息熵、信息量、生物熵及表观平衡常数数学模型，为本课题组“网通虹势”理论提供实例支持，为红花质量控制注入新的数学理念。

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