HPLC法同时测定新疆药桑叶中6个活性成分

孙 莲， 严 雷， 勉强辉， 孟海强

(1．新疆医科大学药学院化学教研室，新疆 乌鲁木齐830011;2．乌鲁木齐市防疫站，新疆 乌鲁木齐830011)

药桑是新疆独有的桑品种之一，是我国国内唯一的具有22倍体花性染色体的桑品种，是新疆目前桑品种分类鉴定中唯一的黑桑种，药用价值极高［1］。现代药理研究证明，桑叶具有降血糖、降血压、抗菌和抗病毒等多种药理活性，能预防和治疗糖尿病。黄酮类成分为桑叶的主要功效成分，桑叶黄酮主要为芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素等，桑叶黄酮具有很好的降血糖、降血脂、抗氧化和抗菌等作用［2-11］，分析测定桑叶中黄酮类成分对开发利用新疆的桑叶资源具有重要意义。本实验采用HPLC法对新疆药桑叶中的绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素进行同时测定［12-15］。为新疆药桑叶的质量控制提供了理论与数据支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪 (LC—20，日本岛津公司)。

1.2 试药 绿原酸 (中国药品生物制品检定所，批号100080-200707)，芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所，批号0080-9504)，槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号081-9003)，异槲皮苷对照品 (上海晶纯医药科技发展有限公司，批号27988)，紫云英苷对照品 (上海融禾医药科技发展有限公司，批号 MUST-11092001)，白藜芦醇 (Sigma公司，纯度99%，100 mg/瓶)，乙腈、磷酸为色谱纯;甲醇等均为分析纯。药桑叶采自新疆喀什 (5、6、7、8、9、10月份)及和田，由新疆医科大学药学院生药教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为桑科植物药桑的叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱温40℃;流动相A为0.2% 的磷酸水溶液，B为0.2% 磷酸乙腈溶液，梯度洗脱，0 min，15%B;9 min，20%B，20 min，25%B，30 min，35%B;40 min，40%B。检测波长 360 nm，体积流量0.6 mL/min，进样量20μL。按照上述色谱条件下6种成分的色谱图见图1。

图1 对照品 (A)与样品 (B)色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances(A)and sample(B)

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别精密称取绿原酸5.30 mg、芦丁5.30 mg、异槲皮苷5.20 mg、紫云英苷5.30 mg、白藜芦醇5.40 mg、槲皮素5.50 mg置于5 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素分别为 1.06、1.06、1.04、1.06、1.08、1.10 mg/mL的对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取不同产地不同月份的药桑叶粉末 (过60目筛)5.000 g，置于100 mL三角瓶中，加入甲醇40 mL，超声提取30 min，过滤，滤渣再用40 mL甲醇超声提取30 min，合并滤液，浓缩后，用甲醇定容于5 mL的量瓶中，用时过0.22μm微孔滤膜。

2.3 线性关系的考察 精密吸取上述绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素对照品溶液适量，用甲醇配成对照品混合液，分别精密吸取对照品混合液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5.0 mL的量瓶中，用甲醇稀释成系列质量浓度的混合对照品溶液，分别进样 20μL，以峰面积为纵坐标，以对照品质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程、相关系数及线性范围，见表1。

2.4 精密度试验 精密吸取上述绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇、槲皮素对照品贮备液各200μL，混匀，连续进样6次，进样量20 μL，求得绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素峰面积的RSD(n=6)分别为1.2%、1.8%、2.8%、0.90%、1.9%及1.3%。

表1 6种成分的线性关系Tab.1 Linear relationship of six components

2.5 重复性试验 按2.2.2项下供试品溶液制备方法，平行制备5份喀什地区6月份药桑叶溶液，在上述色谱条件下进行测定，记录峰面积，计算样品中各成分的量。得绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素的RSD分别为1.6%、1.0%、1.8%、2.4%、0.80%、2.6%，表明该实验的重复性良好。

2.6 稳定性试验 按2.2.2项下制备喀什地区8月份药桑叶供试品溶液，分别于0、2、4、8、10、12、24 h进样20μL，记录峰面积，计算样品中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素量的 RSD分别为 1.6%、1.8%、2.6%、1.8%、0.60%、1.4%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率 精密称取已知绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素量的喀什地区6月份药桑叶粉1.000 0 g，置于100 mL三角瓶中，共6份，于每份中加入绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素对照品溶液适量，按2.2.2项下制备供试品溶液，进样20μL，计算各对照品的平均加样回收率和RSD，见表2。

表2 加样回收率 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

2.8 样品测定 由保留时间及在样品中加标峰增高法定性可知，新疆药桑叶中含有绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素。精密称取不同产地不同月份的药桑叶样品5.000 0 g，各5份，按2.2.2项制备供试溶液，在上述色谱条件下，分别进样20μL。记录峰面积，代入回归方程计算得药桑叶中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇及槲皮素量，结果见表3。

由以上测定结果可知，药桑叶中绿原酸的量较高，嫩桑叶中绿原酸的量最高，随着桑叶的逐渐成熟，量逐渐降低。药桑叶的黄酮类成分中芦丁和异槲皮苷的量较高，紫云英苷和槲皮素的量中等，白藜芦醇的量较少。芦丁和紫云英苷的量随着桑叶的逐渐成熟，逐渐升高，到10月份时，含有量有所降低;异槲皮苷、白藜芦醇及槲皮素的量随月份的不同变化无规律。

表3 样品测定结果 (n=5)Tab.3 Results of contents determination of samples(n=5)

3 讨论

3.1 流动相的选择 分别以乙腈-0.01 mol/L醋酸铵水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、0.2%磷酸水溶液-0.2%磷酸乙腈溶液为流动相。发现选择乙腈-0.01 mol/L醋酸铵水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液及甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相，在不同的梯度时，芦丁、异槲皮苷和紫云英苷都无法达到基线分离，选用0.2%磷酸水溶液-0.2%磷酸乙腈溶液为流动相时，梯度洗脱，6种成分均达到了基线分离，同时梯度洗脱中随着0.2%磷酸乙腈溶液比例的增加，色谱峰的对称性增强，峰的拖尾现象减少了。故本实验选择0.2%磷酸水溶液-0.2%磷酸乙腈溶液为流动相，梯度洗脱。

3.2 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器，对6种对照品溶液进行了200～400 nm紫外扫描，发现绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇、槲皮素的λmax分别为 254、355 nm、254、360 nm、254、360 nm、260、355 nm、260、360 nm、265、366 nm。对样品溶液分别在254、260、265、355、360、366 nm波长下的色谱峰进行比较，发现在检测波长为360 nm时，6种成分均有最大吸收，且峰形较好，基线平稳，分离度较高，故将检测波长定为360 nm。

［1］江苏新医学院．中药大辞典:下册［M］．上海:上海科学技术出版社，1985:1963．

［2］李向荣，方 晓，俞灵莺．桑叶黄酮抗氧化及抑制蛋白糖基化作用［J］．浙江大学学报:农业与生命科学版，2005，31(2):203-206．

［3］陈玲玲，刘 炜，陈建国．桑叶黄酮对糖尿病小鼠调节血糖的作用机制研究［J］．中国临床药理学杂志，2010，26(11):835-838．

［4］张雁冰，戴桂馥，侯立芬．马桑叶中黄酮类化合物的生物活性研究［J］．郑州大学学报:理学版，2009，41(4):62-66．

［5］李先佳，任丽平，王家国．桑叶黄酮和多糖对2型糖尿病大鼠生化指标的影响［J］．中国老年学杂志，2009，29(19):2536-2537．

［6］王 珂，王瑞坡，李 姣，等．桑叶黄酮对腺嘌呤诱导大鼠高尿酸血症肾损伤的防治作用［J］．天然产物研究与开发，2012，24(2):172-175．

［7］刘英华，薛长勇，王 觐，等．桑叶黄酮对小鼠餐后血糖的影响及对α-葡萄糖苷酶抑制作用［J］．中华预防医学杂志，2009，443(1):80-81．

［8］方 飞，吴新荣，罗明俐，等．桑叶有效部位对胰岛素抵抗HepG2细胞体外糖代谢的影响［J］．广东药学院学报，2011，27(6):637-639．

［9］迟晓喆，曹光群．桑叶总黄酮的提取及其抑菌活性研究［J］．林产化学与工业，2012，32(2):163-166．

［10］王 萍．桑叶总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(19):185-187．

［11］王 芳，乔 璐，淡小艳，等．桑叶黄酮的提取及抗氧化研究［J］．广东农业科学，2011，38(15):76-79．

［12］戴开金，罗奇志，侯连兵，等．HPLC法测定桑叶中芦丁、绿原酸和槲皮素［J］．南方医科大学学报，2009，29(3):579-580．

［13］陈秋虹，徐 慧，蒋艳芳．高效液相色谱法测定桑叶中的绿原酸和芦丁的含量［J］．中华中医药杂志，2009，24(5):663-665．

［14］严安定，袁 野，吴 亮，等．HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量［J］．安徽医药，2011，15(3):296-298．

［15］吴秋生，王 俊，吴福安，等．用反相高效液相色谱-紫外检测法测定桑叶中芦丁、槲皮素和1-脱氧野尻霉素的含量［J］．蚕业科学，2009，35(1):134-136．