侧脑室内促肝细胞生长素对脑积水大鼠的干预作用

张绍林刘锋△王占祥 刘希尧朱宏伟沈上杭徐昊

脑脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)循环吸收通路纤维化引起CSF回流和吸收障碍，在脑积水形成过程中的作用倍受关注[1,2]，已从尸体解剖[3]和动物模型[4]中找到了纤维化的组织学证据。研究表明，转化生长因子β1(transforming growth foctor beta 1,TGF-β1)是一种极其重要的强效致纤维化因子，可刺激细胞外基质（extracellular matrix,ECM）成分的表达并沉积于CSF循环通路，引起CSF回流和吸收障碍。ECM蛋白的降解主要由基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）介导，在MMPs中亦已证明MMP-2和MMP-9能降解由TGF-β1信号通路产生的ECM成分[5]。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)与TGF-β1的生物活性在很多方面是互逆的，同时HGF也可促进多种细胞系表达MMP-9，进而促进EMC的分解代谢[6,7]。促肝细胞生长素(hepatocyte growth-promoting factor,pHGF)具有促进细胞分裂增值，改善器官纤维化等作用，与HGF有相似的作用[8-10]。本研究通过在制作脑积水模型的同时给予侧脑室pHGF持续干预，探讨其对脑积水的干预作用和可能的作用机理，为脑积水的局部治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 清洁级健康雄性SD大鼠40只，体质量（250g±10）g，动物生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005（上海斯莱克实验动物有限责任公司），使用许可证号：SYXK(闽)2008-0003（厦门大学实验动物中心）。采用随机数字表法分成2组：pHGF干预组（实验组，n＝20），生理盐水干预组（对照组，n＝20）。试剂与设备：pHGF（长春富春制药有限公司）；高岭土（西陇化工股份有限公司）；鼠TGF-β1和HGF单克隆抗体、羊MMP-9多克隆抗体（美国Santa cruz公司）；即用型免疫组织化学检测试剂盒、血清封闭液（福建迈新生物技术开发有限公司）；大鼠脑立体定位仪（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司）；Alzet2002型植入式微渗透泵（美国Alzet公司）；磁共振仪(7T，美国VARIAN公司)。

1.2 动物模型建立及干预 取健康SD雄性大鼠，称重，10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉，剃除额顶部毛发，头部固定于大鼠脑立体定位仪上，调整门齿杆及双侧耳杆保持大鼠头顶部水平位，碘伏常规消毒铺巾；头顶正中切口切开头皮约1.5cm，钝性分离皮下组织，暴露前囟；取前囟后0.8 mm，中线旁开1.6 mm，钻孔至硬脑膜；微量进样器吸取3%灭菌高岭土生理盐水混悬液30μL，固定于立体定向仪上，垂直进针约3.7 mm，以10μL/min速率缓慢注入；缓慢拔出微量进样器后，将Alzet微渗透泵脑灌流插管垂直插入约3.7mm，耳脑胶固定，套管通过导管与微渗透泵链接，渗透泵置于肩胛骨之间，实验组渗透泵储药囊中装满40mg/mL的pHGF，对照组渗透泵储药囊中装满生理盐水；固定渗透压泵，缝合皮肤；术后每饮水瓶添加阿莫西林胶囊1粒抗炎。

1.3 Morris水迷宫检查 术后第10天，利用Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力。Morris水迷宫直径 1.5m，高 50cm，平台高 30cm、直径10cm，水深42cm，水中加入适量墨汁使其不透明，保持水温在22℃±1℃，水迷宫外视觉线索相对固定。将Morris水迷宫以水池边缘相等分布的4个点作为入水点，将圆形水池等分为4个象限，平台位于第一个象限内（目标象限），在水面下2cm。术后11d分别行：①定向航行实验，随机选择入水点，将大鼠面向池壁放入水中，允许大鼠用60s找到隐藏在水下的逃逸平台并在平台上停留15s（即逃逸潜伏期）；如果在规定时间内找不到平台（逃逸潜伏期以60s记），实验者帮助其找到平台并允许在平台上停留15s，每天实验3次，每次间隔1h，持续4d；②空间探索实验：定向航行实验完成后，次日行空间探索实验。移除平台，动物从远离平台的最远入水点放入，让其自由游泳，时间为60s。整个实验过程均用摄像系统进行监控，并记录各象限的游泳时间分布。

1.4 磁共振成像（MRI）检查 术后第16 d行MRI检查，扫描参数如下：T2WI冠状面，层厚1mm，层数 25，TE50ms，TR5000ms，FOV5.0cm×5.0cm，Matrix256×256。根据大鼠三脑室层面侧脑室最大横径[11]，＜1.0mm 为正常，≥1.0～1.5mm 为轻度脑积水，＞1.5～2.0mm 为中度脑积水，＞2.0mm 为重度脑积水。计算侧脑室指数＝侧脑室最大横径/同一层面脑组织最大横径。

1.5 RT-PCR检测脑组织中TGF-β1、HGF和MMP-9的mRNA水平 MRI检测后24h内处死大鼠，取脑，按照说明书抽提RNA，测定RNA纯度、浓度后进行RT-PCR。引物由广州英韦创津生物科技有限公司合成，具体序列如下：TGF-β1：5'-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3'，5'-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3'；HGF：5'-ACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTA-3'，5'-CATCAAAGCCCTTGTCGGGATA-3'；MMP-9：5'-CACTGTAACTGGGGGCAACT-3'，5'-CAGAAGGACCAGCAGTAGGG-3'；β-actin：5'-CAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3'，5'-CCCTCATAGATGGGCACAGT-3'。反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，55～65℃退火15s，72℃延伸20s，共 45个循环。以β-actin基因作为内参照，采用相对定量2-△△Ct法计算脑组织中TGF-β1、HGF和MMP-9的mRNA的相对表达量。计算公式：目的基因相对表达量＝2-△△Ct，△△Ct＝（待测组目的基因平均 Ct值－待测组内参基因平均Ct值）－（对照组目的基因平均Ct值－待测组内参基因平均Ct值）。

1.6 HE和免疫组化检查 脑组织置于10%中性福尔马林固定液固定24～48h，石蜡包埋，后切成5µm切片。HE染色观察室周及额叶皮质的病理改变；免疫组化采用即用型非生物素法广谱试剂盒法测定脑组织中TGF-β1、HGF和MMP-9的蛋白表达（具体实验步骤参照抗体和试剂的说明书进行操作），染色以细胞胞浆或胞核中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应，定性观察其蛋白表达变化。随机观察5个视野（400倍），分别计数有染色的阳性细胞，将各视野中阳性细胞的平均百分数作为该切片的阳性细胞百分数。

1.7 统计学处理 应用GraphPad Prism®(Graph-Pad,Inc.,La Jolla,美国)软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示，两组数据均数之间的比较采用t检验，多组数据之间均数的差异采用单因素方差分析；两组数据间率的比较采用Fisher精确概率法；检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 实验动物一般情况 实验过程中3只大鼠死于麻醉和手术创伤（实验组1只，对照组2只）。术后早期主要表现为：进食减少，体重减轻，活动减少，攻击性下降，咳嗽，易怒，尿量增加，后腿无力，眼、鼻血性分泌物，驼背等，这些症状随后可缓慢自发消失。两组实验动物之间没有明显差异。

2.2 Morris水迷宫实验结果 在定向航行实验中，实验组大鼠找到平台的潜伏期短于对照组，差异均有统计学意义（t1d=4.536，t2d=2.487，t3d=2.741，t4d=6.430；P 0.05），如表1 所示。在空间探索实验中，实验组动物在目标象限（第一象限）游泳时间长于对照组，两组之间差异有统计学意义（t1=6.845，P＜0.05）；且实验组在对侧象限（第三象限）游泳时间短于对照组，差异有统计学意义（t3=2.380，P＜0.05），如表2所示。

表1 定向航行实验中对照组和实验组不同时间的潜伏期

2.3 MRI检查结果对照组均形成了不同程度的脑积水：重度10只，中度5只，轻度3只，大部分呈现脑室系统明显扩大，室周组织受压、水肿（图1A）；而实验组脑室扩大相对较轻（图1B）：重度脑积水5只，中度6只，轻度脑积水6只，无明显脑积水2只，大部分无明显室周组织水肿。对照组侧脑室指数为（0.61325±0.11691），实验组侧脑室指数为（0.47625±0.14116），两组间侧脑室指数比较，差异有统计学意义（t=3.205，P＜0.05）。

2.4 脑组织中TGF-β1、HGF和MMP-9的mRNA检测 RT-PCR结果，如表3所示，实验组TGF-β1的mRNA表达水低于对照组，两组之间的差异有统计学意义（t=22.359，P＜0.05）。而 HGF 和 MMP-9 的mRNA表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（t=17.496，P＜0.05和t=16.155，P＜0.05）。

2.5 HE和免疫组化检查结果 HE染色示，对照组脑室周围组织肿胀、结构紊乱及胶质增生带，胶质细胞增生和细胞水肿、液化、变性；与此相反，实验组相对较轻，如图2所示。

免疫组化结果提示，对照组和实验组大鼠脑室周围及额叶皮质中TGF-β1的阳性表达率分别为76.2%和30.6%，经Fisher精确概率法检验两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。而HGF和MMP-9在对照组和实验组的阳性表达率分别为49.2%、91.2%和52.4%、94.8%，经Fisher精确概率法检验差异均有统计学意义(P＜0.05)。如图3所示。

图1 MRI检测对照组与实验组大鼠脑积水表现

图2 大鼠脑室周围和额叶皮质组织病理学改变（HE×400倍）

表2 空间探索实验中对照组和实验组各象限的游泳时间分布

表3 实验组和对照组中TGF-β1、HGF和MMP-9的mRNA相对表达水平

图3 免疫组化显示实验组和对照组中TGF-β1、HGF和MMP-9的表达（ICH×400倍）

3 讨论

TGF-β1可促进ECM蛋白的合成、抑制MMPs的活性和表达，在其他纤维化疾病中得到了广泛研究[12-14]，在脑积水形成过程中同样起重要作用。ECM沉积和MMPs活性增加，是纤维化疾病的共同病理特征，脑积水时同样存在ECM的过度沉积，ECM蛋白的降解主要由MMPs介导。研究发现MMP-9的活性高低与脑室出血后脑积水的自行缓解有关，MMP-9高表达的脑积水患者可逃避分流术[15]。Jeong等[16]研究发现HGF可降低脊髓损伤后的胶质瘢痕形成和促进轴突生长，现已证明是一种很有前景的抗纤维化因子,已用于多种纤维化疾病的抗纤维化研究[17-19]等。

本研究中对照组大鼠MRI显示均形成了不同程度的脑积水，病理学检查可见室周组织肿胀、结构紊乱及胶质增生带，明显的胶质细胞增生和细胞水肿、液化；与此相反，实验组大鼠形成的脑积水相对较轻，脑室扩张较小，病理学改变较对照组明显减轻。说明脑积水时存在局部炎症反应和胶质增生，符合纤维化特征，而pHGF具有改善局部炎症和胶质增生，降低纤维化作用，从而延缓脑积水的形成和进展。TGF-β1、HGF和MMP-9在脑积水时表达均升高，可能是因为脑积水时高表达的TGF-β1促进ECM沉积，沉积的ECM反馈性诱导HGF和MMP-9高表达，继而促进ECM降解。免疫组化和PCR结果均显示实验组TGF-β1表达被抑制，HGF和MMP-9表达进一步升高，与pHGF在其他纤维化疾病中的研究报道一致[20-22]。因此，我们推测pHGF是通过下调TGF-β1表达、上调HGF和MMP-9表达，减轻局部炎症反应和胶质增生来发挥抗脑积水的形成作用。但在脑积水形成演变过程中，各时期哪种作用占主导仍需进一步研究。

脑积水时因增大的脑室对周围的组织、血管压迫，形成纤维瘢痕，以及组织缺血缺氧，引起空间学习记忆能力改变[23]。实验发现对照组大鼠空间学习记忆能力明显受损，经pHGF干预的大鼠空间学习记忆能力受损相对较轻，说明pHGF有助于改善空间学习、记忆能力，与HGF干预脑积水有着异曲同工的效果[24]。其作用机理，我们分析可能是通过抑制组织纤维化和胶质增生，影响局部炎症等介质的释放，减轻扩大的脑室对脑组织的压迫，减轻了脑水肿等，直接或间接改善其空间学习记忆能力。

综上所述，外源性pHGF对高岭土诱导的脑积水大鼠具有一定的治疗作用，其作用机制可能是一方面通过抑制TGF-β1表达，促进HGF和MMP-9表达来实现；另一方面减轻CSF循环通道的炎症反应和胶质增生，发挥抗纤维化作用。同时表明脑积水局部干预切实可行，但选择何种高效的干预介质，仍需要进一步探索。

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