儿童用品中亚硝胺检测方法研究进展

李 丕 白 桦 张 庆 李文涛 吕 庆 李海玉 王 烨 郭项羽

（中国检验检疫科学研究院 北京 100123）

1 前言

亚硝胺是一类具有-N-N=O结构的有机化合物，在100多年前被发现，但直到1956年英国学者Magee和Barnes发现N-亚硝基二甲胺（NDMA）对试验动物具有强致癌活性，亚硝胺才受到世界范围的广泛关注。迄今为止已发现的300多种亚硝胺中90%左右可以诱发39种动物不同器官的肿瘤，并且一次大量摄取和少量多次摄取均可诱发肿瘤[1]。美国环境保护署（Environment Protection Agency, EPA）污染物风险信息集成系统（Integrated Risk Information System, IRIS）将亚硝胺的风险指数定为B2，即具有潜在人体致癌性[2]。亚硝胺广泛分布在土壤、工业废水、橡胶制品、皮革、化妆品、烟草及腌制食品中，可通过呼吸道、消化道、皮肤吸收等途径进入人体产生危害，其靶器官包括肝、肾、肺等。1980年，Preussmann发现婴儿奶嘴、橡胶奶嘴含有挥发性的亚硝胺，可迁移到唾液中[3]。1982年，Havery和Fazio发现使用传统消毒器对婴儿奶嘴和牛奶或婴儿药方消毒时，牛奶和药液中被混入亚硝胺[4]。儿童成长过程中，不可避免地会使用到橡胶奶嘴、安抚奶嘴，以及磨牙胶、婴儿牙刷、气球等橡胶制品，为保护儿童免受亚硝胺致癌物的污染，有必要开发儿童用品中亚硝胺的检测方法。另外我国是玩具出口大国，为保障玩具对外出口贸易的顺利进行，有必要建立适应于我国产业现状的检测标准。

2 儿童用品中亚硝胺污染情况

近30年来，研究人员陆续在婴儿奶嘴[4,5]、安抚奶嘴[6]、气球[2,7,8]、乳胶手套[9,10]、牙齿矫正器的橡皮圈[11]等橡胶制品中发现亚硝胺及其前体物质。

2001年荷兰市场上57个气球样品用人造唾液迁移1h，全部检测出二甲基亚硝胺及其前体物质；60%的样品中检测出二丁基亚硝胺及其前体物质；其余还检测出二乙基亚硝胺、亚硝基二苄胺、二异丙基亚硝胺和亚硝基吗琳；仅有一个样品符合限量标准[7]。

德国学者Altkofer W 对德国市场上的气球进行了亚硝胺含量检测，结果显示：2001年对16个气球样品检测，不合格率81%；2003年对14个气球样品检测，不合格率93%；超出德国的限量标准0.01mg/kg[8]。

2011-2012年，幸苑娜等对我国市场上的气球样品、婴儿奶嘴样品进行亚硝胺含量检测，气球样品中检出N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二丁胺，N-亚硝基吡咯烷，含量超标[2,12]；奶嘴样品未检出[12]。2012年，杨荣静等对我国市场上的婴儿奶嘴样品进行亚硝胺含量检测，其中3个样品N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二丁胺超标[13]。

3 儿童用品中的亚硝胺来源及种类

儿童用品中的亚硝胺主要产生于橡胶的硫化成型过程。绝大多数橡胶制品都要通过高温硫化最终成型，该过程需使用硫化促进剂。具有仲胺基的硫化催化剂在硫化过程中会给出仲胺，仲胺与空气中或配合剂中的氮氧化物NOX（主要是NO2）在酸性环境或催化剂条件下会生成稳定的N-亚硝胺，如反应式（1）所示：

常用的硫化促进剂如次磺酰仲胺类、秋兰姆类、二硫代氨基甲酸盐类等大多具有仲胺结构。欧洲研究人员以促进剂二硫化四甲基秋兰姆（TMTD）为例研究产生的N-亚硝胺种类和含量，发现N-亚硝胺的生成及产量受很多因素影响，但促进剂TMTD的添加量越大，硫化后检测到的NDMA也越多[14]。另外，使用带仲胺基硫化催化剂的乳胶玩具在使用和存储过程中也可能产生亚硝胺[14]。

儿童用橡胶制品中的亚硝胺种类由所使用的硫化剂的结构决定，主要是脂肪族亚硝胺（氮原子上取代基为烃基）、杂环类亚硝胺（氮原子上取代基含有氧原子等）和芳香族亚硝胺（氮原子上取代基含有苯环）。常被列入儿童用品中检测项目的一些亚硝胺的结构式如图1所示。

图1 儿童用品中的亚硝胺

4 儿童用品中的亚硝胺的相关法规及政策

1993年，欧盟官方发布了93/11/EEC指令，规定弹性体或橡胶奶嘴和安抚奶嘴中总亚硝胺的迁移量不得高于0.01mg/kg，总可亚硝化物质的迁移量不得高于0.1mg/kg。

1999年，欧洲标准委员会出台了婴儿橡胶奶嘴及抚慰品中迁移出亚硝胺及可亚硝化物质的检测方法标准（BS EN 12868: 1999）[15]，方法给出了11种亚硝胺的检测方法，规定该类产品中N-亚硝胺的总含量不得高于0.01mg/kg。

1999年，美国材料与试验协会出台了婴儿奶嘴中亚硝胺含量的检测方法标准（ASTM F1313-90 (2009)）[16]给出了8种挥发性亚硝胺的检测方法，每种亚硝胺含量不得高于0.01mg/kg，N-亚硝胺的总含量不得高于0.02mg/kg。

2001年10月欧盟发表的《未来化学品政策战略白皮书》，已将可产生N-亚硝胺类化合物硫化剂DTDM（二硫化吗啉）和某些秋兰姆类促进剂（如TMTD等）列入限期淘汰的化学品。

2008年，德国对《德国商品法》中有关3岁以下儿童用气球及橡胶玩具所含亚硝胺的现行国家标准进行修订，规定总亚硝胺的迁移量不得超过0.05mg/kg，总可亚硝化物质的迁移量不得高于1.0mg/kg；并规定小于36个月的儿童所使用的玩具的入口部分的亚硝胺及可亚硝化物质的迁移量必须满足93/11/EEC指令中的相关规定。

2009年6月，欧盟在官方刊物上正式发布了《玩具安全新指令》（2009/48/EC），规定供3岁以下婴儿使用的玩具和供儿童放入口中的玩具严禁使用亚硝胺；工艺过程无法避免的，其总亚硝胺的迁移量不得高于0.05 mg/kg，总可亚硝化物质的迁移量不得高于1.0 mg/kg。

2009年我国最新发布的国家标准橡胶及弹性体材料 N-亚硝基胺的测定（GB/T 24153-2009）规定橡胶和弹性体材料中12种N-亚硝胺，每种含量不得高于0.5 mg/kg[17]。

5 亚硝胺的分析检测方法

5.1 前处理方法

相对于亚硝胺总量检测，儿童用品中亚硝胺迁移量检测更有实际意义。迁移量的测定，一般先用模拟体系溶液（模拟唾液、模拟汗液等）对儿童用品进行迁移，再用二氯甲烷对迁移到模拟体系溶液中的亚硝胺进行液液萃取，浓缩检测[1,15]。但是液液萃取耗费大量有机溶剂、操作繁琐，并且对于水溶性较强的亚硝胺（如NDMA）回收率不高，固相萃取技术逐渐成为普遍使用的前处理手段[12,18,19]。近年来，一些新的提取浓缩手段，如固相微萃取[20-22]，液液微萃取[23]也开始应用于亚硝胺的提取浓缩。但目前应用最广泛的是固相萃取方法。

亚硝胺的限量非常严格，直接检测对实验操作及仪器要求较高，对亚硝胺进行柱前衍生再检测能使灵敏度提高1个数量级[24]。但衍生化方法操作步骤较为繁琐，应用并不广泛。

5.2 仪器分析方法

很长一段时间，对于痕量挥发性亚硝胺的测定是一项困难而又耗时的工作。早期的检测手段有薄层层析法、紫外光谱鉴定法等。1975年Fine等人首先发明了对亚硝基结构具有检测特异性的热能分析仪（TEA）[25]，从而成为检测亚硝胺的专属仪器。后来，氮磷检测器（NPD）[26-28]、氢火焰离子化检测器（FID）[27,29,30]、电子捕获检测器（ECD）[29,31]等均用于亚硝胺的检测。近年来，随着仪器的发展，质谱仪（MS）越来越多地用于亚硝胺的检测，气相色谱-质谱联用（GCMS），液相色谱-质谱联用（LC-MS）逐渐成为应用最多的检测手段。

5.2.1 气相色谱-热能分析仪联用法

气相色谱-热能分析仪联用（GC-TEA）检测亚硝胺的工作原理为：含有亚硝胺的样品在GC分离后进入热解器，亚硝胺化合物分子中的N-NO键较弱，在热解器中发生离解，产生亚硝酰基*NO，*NO与臭氧（O3）在真空反应室中反应，生成激发态的NO2*，受激的NO2*迅速衰减，返回到基态NO2，并发射出近红外线（600-3000nm），发出的光线强度与亚硝胺的浓度成正比，由此对亚硝胺进行定量测定。

热能分析仪作为检测亚硝胺的专属仪器，特异性高，灵敏度高（检测限为pg级），目前约有95%的亚硝胺检测工作是通过色谱与热能分析仪联用完成的。儿童用橡胶制品中亚硝胺检测参照最广泛的欧盟标准BS EN 12868: 1999，以及美国材料与试验协会的橡胶奶嘴中挥发性亚硝酸总量检测方法ASTM F1313-90 (1999)[16]均采用气相色谱-热能分析仪联用法。另外，其他产品中亚硝胺检测较为权威的标准，如国际标准天然乳胶制安全套中亚硝胺迁移量的检测方法ISO 29941:2010[32]，以及我国对食品、卷烟主流烟气总粒相物中亚硝胺测定的标准GB/T 5009.26-2003[33]，GB/T 23228-2008[34]，均采用气相色谱-热能分析仪联用检测。

同时，热能分析仪专用性强，并且价格昂贵，使用受到一定限制。近年来随着仪器的发展，质谱仪逐渐成为除热能分析仪之外使用最为广泛的检测仪器，近年来国内外不断有相关研究报道。

5.2.2 色谱-质谱仪联用法

质谱仪灵敏度高、定性准确、适用范围广，仪器从单级质谱到多级质谱，低分辨质谱到高分辨质谱不断发展，近十年成为检测亚硝胺的一个重要手段。

亚硝胺分子量较小，采用单级质谱分析时，使用EI源时，特征碎片离子不明显，受背景干扰较严重。而CI源是一种软化学电离源，主要获得准分子离子峰，少有碎片离子，响应灵敏度高；同时亚硝胺类化合物具有弱碱亲核性，常采用PCI源进行定量检测。当样品基质复杂时，为了防止假阳性，也采用PCI-MS/MS分析。美国环境保护署出台的饮用水中亚硝胺检测方法EPA 521即采用正化学源串联质谱法，检测饮用水中7种亚硝胺，检测限达到1.2-2.1ng/L[18]。

由于CI源只能在低温条件下工作，离子源易受污染，大量分析时需对离子源进行频繁清洗。多级质谱选择性好，灵敏度高，使用EI源多反应检测模式（MRM）能有效克服背景干扰，因此EI-MS/MS也经常用于亚硝胺的定量分析。

幸苑娜先后采用气相色谱-正化学源质谱法[12]和气相色谱-电子轰击源串联质谱法[2]检测了橡胶制品中7种N-亚硝胺，检测限达到1.25μg/kg，远低于93/11/EEC的限量要求。封棣采用气相色谱-质谱法检测了橡胶制品中6种亚硝胺，灵敏度与气相色谱-热能分析仪法相当[22]。2008年，西班牙学者Carles Planas采用气相色谱高分辨质谱检测了水中的9种亚硝胺，定量限达到0.08-1.7ng/L[35]。2011年，Romina Pozzi采用气相色谱-正化学源质谱法测定水中9种亚硝胺，定量限达到1-2ng/L[19]。2012年，日本学者Suchul Yoon采用气相色谱-正化学源串联质谱法，同位素内标检测了废水中8种亚硝胺，定量限达到0.4-3.3ng/L[36]。

气相色谱用于检测基质相对简单的挥发性亚硝胺非常方便，但对于一些难挥发、极性强（如N-亚硝基二乙醇胺）和热不稳定的亚硝胺，以及基质比较复杂的样品，如化妆品、血液、尿液、细胞液等，通常采用液相色谱作为分析手段。N-亚硝基二乙醇胺的正辛醇/水分配系数lg Kow=-1.28（lg Kow＜1为亲水性化合物），溶于水及极性有机溶剂，不溶于非极性溶剂，适合采用液相色谱检测。国际标准化组织检测化妆品中的N-亚硝基二乙醇胺的标准ISO 15819[37]，即采用液相色谱-串联质谱法。Li Chenchen采用液相色谱-串联质谱法检测了家兔血液中的亚硝胺代谢物[38]，Wang Wanfeng采用超高效液相色谱-串联质谱法检测了饮用水中的9种亚硝胺[39]。

6 结语

本文主要介绍了儿童用品中亚硝胺的来源、污染情况、政策法规及已有的检测方法。质谱法，尤其是串联质谱法以选择性好、灵敏度高、普适性强的特点，越来越成为定量测定亚硝胺的重要手段。亚硝胺类物质极性范围较宽，从非极性到中等极性到强极性都有分布，国际上对儿童用品中亚硝胺检测要求的种类越来越多，已有的研究报告中的检测指标多为6-9种亚硝胺，极性较为相近，但对于极性分布较宽的亚硝胺的检测任务，如何建立一个简单的、合适的前处理方法，得到良好的回收率是一个挑战。我国是玩具出口大国，为保障玩具对外出口贸易的顺利进行，有必要建立适应于我国产业现状的检测标准。

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