顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术分析桂油中香气成分

李 达 张 琦 蔡 璇 田 雨 郑锡波 户庆云

（1.肇庆出入境检验检疫局 广东肇庆 526060；2.珲春出入境检验检疫局）

1 前言

桂油是用水蒸气蒸馏法，从植物的地上部分（新鲜或半干的叶和茎）中取得的精油，其中香气成分主要由各种挥发性和半挥发性的物质组成。它是辨别桂油品质的一个重要特征参数。目前，国内外对桂油香气成分的分析还未见报道，因此需要建立一种快速有效的方法对其中的香气成分进行定性分析。

固相微萃取(Solid-Phase Microextraction，SPME)是在固相萃取技术的基础上发展起来的一项新的样品预处理技术。自1990年加拿大的Pawliszyn教授提出固相微萃取技术以来，众多分析工作者对其进行研究，使该技术得到进一步的发展及广泛应用[1-3]。目前, 由于顶空固相微萃取技术集取样、萃取及富集于一体，操作简便，而且具有萃取速度快、操作成本低以及便于实现自动化等优点，已被广泛应用于谷物、酒类、水果等食品香气的分析研究中[4-8]。国内还未见顶空固相微萃取检测桂油香气成分的研究，因此本试验选用肇庆地区出口的桂油，运用顶空固相微萃取方法吸附其挥发性物质，结合气相色谱-质谱联用技术分析香气成分组成和量比关系，对于桂油的品质鉴定具有重要的意义。

2 材料与方法

2.1 材料

Agilent 7890A气相色谱仪：配置 5975C MSD检测器，美国Agilent公司；色谱柱：HP-5MS柱，30×0.25mm×0.25 μm；CTC液体-顶空-固相微萃取三合一自动进样器：瑞士CTC公司；Supelco SPME装置：美国Supelco公司，包括85 μm 聚丙烯涂层纤维（PA，极性）、100μm 聚二甲基硅烷涂层纤维（PDMS，非极性）、50μm 二乙烯基苯-碳分子筛-聚二甲基硅氧烷涂层纤维（DVB/CAR/PDMS，中极性）、75 μm 碳分子筛二甲基硅烷涂层纤维（CAR/PDMS，中极性）。

2.2 方法

2.2.1 顶空固相微萃取

75 um碳分子筛二甲基硅烷（CAR/PDMS）涂层的萃取头在首次使用时要进行老化，参照厂家提供的资料，将萃取头在气相色谱的进样口老化，老化温度为300℃，载气流量为0.5mL/min，老化时间1h。固相微萃取借助于CTC自动进样器完成。准确移取5.00mL混匀的桂油样品于20mL规格的顶空进样瓶中，旋紧瓶盖备用。自动进样器将样品瓶移动到恒温加热器中以500r/min的速度搅拌并在40℃下预热20min，插入萃取头，在相同搅拌速度和加热温度下萃取30min后，萃取头进入GC的进样口在250℃下解析100s。

2.2.2 仪器工作条件

气相色谱条件：柱温采用程序升温，起始温度为60℃，1℃/min升至150℃，保持1min，然后以2℃/min升至250℃，保持10min。进样口温度为250℃；分流比20:1；载气为高纯He（99.999%），流速为0.5mL/min。

质谱条件：EI离子源温度为230℃，电子能量为70eV，四级杆温度为150℃；接口温度为280℃；m/z 50-550。

3 结果与讨论

3.1 萃取纤维涂层的选择

萃取纤维头的选择对待测物质固相微萃取具有重要影响。在其他条件恒定下，本实验比较了85 um 聚丙烯涂层纤维（PA，极性）、100μm 聚二甲基硅烷涂层纤维（ PDMS，非极性）、50μm二乙烯基苯-碳分子筛-聚二甲基硅氧烷涂层纤维（DVB/CAR/PDMS，中极性）、75 μm 碳分子筛二甲基硅烷涂层纤维（CAR/PDMS，中极性）4种不同涂层的纤维头对桂油中的香气成分的的萃取效果。以色谱峰个数和总峰面积作为指标来选择。从表1结果可以看出，85 μm PA和100μm PDMS萃取头出峰数较少且总峰面积较小，50μm DVB/CAR/PDMS和75 μm CAR/PDMS萃取头分离吸附出的化合物数量差异较小，但75 μm CAR/PDMS萃取头的总峰面积较高，分离效果也较好。因此选用75 μm CAR/PDMS萃取头分离样品，各种香气成分的峰型较好且大多数物质得到完全分离。SPME在首次分析前要作空白萃取头试验，排除萃取头和仪器的干扰。萃取头第一次使用前，应该插入气相色谱进样口中解析，以确保涂层本身不带入污染物或干扰组分。当分析完含一定量高分子化合物的样品后，也要重复上述的操作以防止对下一次分析造成污染[9]。上述4种纤维涂层的萃取头使用条件见表2。

表1 不同纤维涂层对桂油萃取效率的影响

表2 不同纤维涂层的使用条件

3.2 样品量的选择

为了保证一次SPME萃取量近似于样品中被测物总量，需对取样量进行考察，以避免萃取纤维吸附出现饱和情况。分别吸取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL于20mL顶空萃取样品瓶中进行分析，结果表明，样品量在5mL以下SPME为非饱和吸附，见图1。

3.3 萃取温度的选择

萃取温度增高能增加顶空挥发性物质的浓度，有利于它们的萃取。然而SPME是一个放热过程，当温度高到一定程度后，化合物的萃取量反而减少[10]。本实验比较了30℃、40℃、50℃、60℃不同温度条件下对萃取效果的影响，结果表明，升高温度可以增强香气成分的萃取效果，但当温度超过到40℃时桂油中香气成分的总峰面积呈下降的趋势，所以选用40℃作为萃取温度，见图2。

图1 不同样品量对桂油萃取效率的影响

图2 不同萃取温度对桂油萃取效率的影响

3.4 萃取时间与搅拌速度

为保证实验数据的重现性，在实验中应保持一定的萃取时间。顶空固相微萃取法是一种在平衡状态测定被分析物的方法，分析物的平衡状态由分析物在系统三相中的物质分配决定。这三相包括聚合物薄膜、空气和基体。在萃取初始阶段，分析物很容易且很快富集到石英纤维固定相中，随着时间的延长，富集速度越来越慢，一旦被分析物在三相中达到平衡，它们在每一相中的质量浓度为一常数，时间的延长对富集没有任何意义。所以，要准确测定分析物在聚合物薄膜中的质量浓度，首先要使系统达到平衡状态，该状态可通过被分析物的萃取时间与总峰面积测定。本实验对达到吸附平衡所需时间作了考察，在20、30、40、50min分析结果中，30min达到吸附平衡，因此选择萃取时间为30min。见表3。增加搅拌速度不仅能加快被萃取物进入气相的速度，还能加强上方气体的流动，有利于被萃取物在气体中的传递，提高了被分析物的萃取效率。选择250、500、750r/min作为考察，实验表明可能本实验所用样品量较少，搅拌速度对吸附效率并无显著性影响。因此，本实验选取仪器推荐的500r/min最为搅拌速度。

表3 不同萃取时间对桂油萃取效率的影响

3.5 解析时间及样品预热时间

解析过程受进样口温度，解析时间、待测物性质等因素影响，较高的进样口温度可以缩短解析时间，当固相微萃取后在气相色谱进样口解析时，若解析时间过短就有可能导致解析不完全，会影响下一次的萃取量，出现误差。本实验对热解析温度为230℃、240℃、250℃、260℃和解析时间30s、50s、100s、150s和200s进行正交试验。结果表明，解析温度250℃解析时间100s即可达到充分解析，总峰面积基本不变。对20、30、40和50min预热时间的考察结果表明，样品预热20-40min,样品的吸附效率达到一个稳定的状态，但随着预热时间的延长，香气成分吸附呈下降趋势，故选30min适宜。

3.6 重复性实验

使用顶空-固相微萃取萃取桂油中的香气成分，涉及到吸附和解析附的一系列复杂的物理化学平衡过程。在此过程中，精确的温度控制是定量准确与否的关键。由于本实验采用CTC自动进样器，具有精密控温的加热装置。在所有装有样品的顶空瓶中温度严格控制在±0.1℃以内，6次实验结果的变异系数CV%均小于5%。见表4，表5。

表4 保留时间的重复性

表5 色谱峰面积的重复性

3.7 桂油中香气成分测定结果与分析

采用本方法检测桂油中的香气成分，经气相色谱质谱分析总离子流图如图3所示。通过计算机NIST08标准谱库检索和人工解析，共鉴定出41种组分的化学结构，相对含量占总检出化合物的97.68%。从表6可以看出，桂油的香气成分可分为醛类、烯类、酯类等化合物。其中醛类化合物的相对含量约占81%，是桂油香气中含量最高的物质。烯类化合物的相对含量约占10%，这些成分基本代表了桂油香气成分中的特征香气物质。 桂油有春桂油和秋桂油之分。春桂油，简称春油，是清明前后采剥桂皮时修下枝叶所蒸馏的油。含油量较低，鲜枝叶的出油率为0.3%-0.4%。秋桂油，简称秋油，乃秋季采摘枝叶所蒸的油。出油率较高，鲜枝叶的出油率为0.4%-0.5%。而春油比秋油的香气成分略有不同，且春油价格也要贵一些。本实验分别鉴定春油和秋油的香气成分得出：春油香气中的烯类物质约占10%、醛类物质约占81%；而秋油香气中的烯类物质约为13%、醛类物质约占78%。其中桂油中的主成分反式-肉桂醛两者的相对含量春油比秋油略高，而秋油中的乙酸肉桂酯含量比春油略高，评价桂油的质量是以含醛量多少为标准，因此春油质量优于球油。

图3 桂油香气成分GC-MS总离子图

表6 桂油香气成分的GC-MS分析结果

（续表）

4 小结

采用顶空-固相微萃取方法测定桂油中的香气成分，通过优化萃取纤维以及实验条件取得了较好的效果。它克服了传统样品处理技术如：液液萃取、蒸馏萃取、顶空进样、超临界流体萃取、吹扫-捕集法等需样品量大、耗时过长、花费太高等一些缺陷，不易引起香气成分化学结构的变化或组成成分的变化，较能准确的反映出样品挥发性组分的组成。本实验桂油的香气成分主要为反式-肉桂醛、苯甲醛、顺式-肉桂醛、苯乙烯、香豆素、乙酸肉桂酯、水杨醛等。其中反式肉桂醛的相对含量约占70%，为桂油香气中含量较高的特征化合物。

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