杂多酸季铵盐双活性中心抗菌剂的合成及抑菌性能研究

杨万丽 王丽艳 王清文

(1东北林业大学生物质材料科学与技术教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

(2齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，齐齐哈尔 161006)

有机-无机杂化材料是一个新的研究开发领域，这种材料兼有有机材料与无机材料的特性，并能通过改变材料功能的负荷以实现性能的互补与优化[1-2]。绿色多酸新功能的开发是其应用中追求的主要目标之一。在Kiengg结构取代型的杂多钨酸盐中，取代金属离子位于类卟啉环境中，比经典酸具有更高的化学活性[3-5]。具有不同官能团高分子化后的季铵盐吸附菌体及与细胞膜结合能力不同，抗菌性和稳定性也不同[6]。季铵阳离子因含有疏水基团，可与杂多酸阴离子形成盐，成为超分子化合物。杂多酸季铵盐可整体看做是一个有机物和无机物的离子对，杂多酸附着在季铵盐的长链中[7]。目前将杂多酸(主要为经典多酸)与季铵盐杂化材料主要作为相转移催化剂，较多的应用于烯烃氧化及环氧化体系和醇的氧化体系[8-12]。为了开发新功能领域，一个可行性的战略就是改善多酸的活性。将新型缺位取代多酸与季铵盐复合产生高效低毒的抗菌效果，从而开发绿色杂多酸新的功能领域。

因此本文提出了杂多酸抗菌的新思路：通过分子设计，将活性较高的取代型杂多酸(盐)引入季铵盐，形成具有双活性中心的超分子化合物，以制备更有效的环境友好型抗菌剂，从而拓展杂多酸在抗菌材料领域的应用。本文采取立体有择法合成以过渡元素V、Fe、Co和Ni为取代原子的 Keggin结构取代型磷钼杂多酸盐，在水热条件下，与十二烷基三甲基溴化铵(C15H34NBr)通过离子交换合成4种杂化材料， 用元素分析、IR、UV、TG、XRD、SEM、TEM对目标产物进行了表征，测试了材料对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑菌性能。结果表明，材料的抑菌性能要优于杂多酸和季铵盐。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

P．E．2400 型元素分析仪(美国 P．E．公司)，美国Leeman Lab ICP发射光谱仪，S3400扫描电子显微镜(日本日立公司)，H-7650透射电子显微镜(日本日立公司)，79-1恒温磁力搅拌器 (江苏省金坛市医疗仪器厂)，pH-25型酸度计 (上海精密科学仪器有限公司)，Spectorm-One 型红外光谱仪(美国 P．E．公司)，TU-1901型紫外光谱仪 (北京普析通用仪器有限责任公司)，BD90型X-射线粉末衍射仪 (北京大学制造)，DF40型热重-差热分析仪(日本岛津)，细菌培养器，钼酸钠、磷酸二氢钾、偏钒酸铵、氯化钴、硫酸亚铁、硫酸镍、氯化钾、十二烷基三甲基溴化铵、盐酸、胰蛋白胨、氯化钠、酵母提取物等试剂均为分析纯。

1.2 杂多酸季铵盐抗菌剂的制备与表征

杂多酸-PMo11O39·x H2O 按文献[13]的方法合成，杂多酸 K3H2[PMo11V(H2O)O39]·7H2O(记作 PMo11V)、K3H2[PMo11Fe(H2O)O39]·9H2O(记作 PMo11Fe)、K3H2[PMo11Co(H2O)O39]·10H2O(记作 PMo11Co)和 K3H2[PMo11Ni(H2O)O39]·7H2O(记作 PMo11Ni)按文献[14]的方法合成，经红外光谱法鉴定结构。

杂多酸季铵盐(记作C15H34N-PMo11M)的合成方法：在100 mL三角烧瓶中准确称取 6．654 0 g PMo11V盐，加入30 mL蒸馏水使其溶解；另准确称取0．333 0 g C15H34NBr溶于5 mL蒸馏水配成溶液。在搅拌下将配制好的C15H34NBr溶液慢慢加至PMo11V盐溶液中，于40℃磁力搅拌反应2 h，析出大量晶体。停止搅拌，抽滤，用蒸馏水洗涤，滤饼置于50℃真空干燥器中干燥1 h，得杂多酸季铵盐C15H34N-PMo11V。其它杂多酸季铵盐抗菌剂的制备方法同上。

制备的杂多酸季铵盐分别采用元素分析、红外光谱、紫外光谱、X-射线衍射分析(XRD)、热重分析(TG)和形貌分析(扫描电子显微镜SEM、透射电子显微镜TEM)等方法进行表征。

1.3 菌种培养

1．3．1 金黄色葡萄球菌

无菌条件下取25 mL食品样品，放入225 mL灭菌生理盐水中均质，制成10∶1(V/V)稀释液，将稀释液接入7．5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，在37℃条件下培养24 h。将上述稀释液或培养液分别划线皿平板和Baird-Parker平板，置37℃培养24～48 h 备用[15]。

1．3．2 枯草芽孢杆菌

将芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种与营养琼脂培养基斜面上，然后在恒温箱内37℃培养24 h，即可见到一层白色圆整、边缘光滑的枯草芽孢杆菌菌落。将固体培养基上已培养好的芽孢杆菌无菌接种到5 mL营养肉汤培养基中，摇匀，37℃摇床内培养24 h，然后接种到100 mL(含5%黄豆)的豆浆中，37℃震荡培养24 h备用[16]。

1．3．3 大肠杆菌

将菌株植入营养肉汤培养，在37℃摇床约18 h，营养肉汤琼脂培养基平皿画线培养，置于37℃隔水恒温培养箱中约24 h，挑去单个菌落于营养肉汤琼脂斜面培养基中培养，置于37℃隔水恒温培养箱中约24 h备用[17]。

2 结果与讨论

2.1 元素分析

C、H、N 含量用元素分析仪测定，P、V、Fe、Co、Ni、Mo含量采用发射光谱仪测定，K含量用原子吸收分光光度法分析，结晶水数目由热重分析得到，元素分析结果列于表1。所得标题化合物的元素分析实验值与计算值基本吻合。

表1 元素分析结果(实验值)Table 1 Elemental analysis(experimental)results

2.2 红外光谱

采用KBr压片，波数范围4 000～400 cm-1对原料及产物进行红外谱图解析。

由表2数据和图1可知：合成标题化合物以后，杂多阴离子IR光谱的特征振动频率基本不变，这表示标题化合物仍保持Keggin骨架[18]。文献报道[19]，在C15H34NBr分子中，饱和的C-H伸缩振动出现在3 000 cm-1以下，-CH2-的吸收峰在(2 930±5)cm-1附近反对称伸缩振动，在(2 850±10)cm-1附近对称伸缩振动。当其与多酸化合后，所有的吸收峰位置均有不同程度的位移，其中P-Oa键和Mo-Od键蓝移 20 cm-1左右，Mo-Ob-Mo 键红移 2～3 cm-1，Mo-Oc-Mo键红移3～15 cm-1，表明形成标题化合物后，杂多阴离子中的化学键由于受到季铵盐阳离子的作用有不同程度的减弱或增强，季铵盐比表面积大，季铵盐与多酸离子之间由于静电引力的作用结合，杂多酸附着在季铵盐的长链中，有机铵阳离子较H+半径大，阳离子的体积效应削弱了阴离子与阴离子之间的相互作用，从而使杂多阴离子中金属-氧键减弱，使吸收峰红移。

2.3 紫外光谱

标题化合物水溶液的紫外吸收光谱均给出2个吸收峰(表3)，在200 nm左右的是Od→Mo的荷移跃迁产生，在260 nm左右的是由Ob/Oc→Mo荷移跃迁产生，它是Keggin结构杂多酸盐阴离子的特征吸收峰[20]，表明标题化合物仍保持Keggin结构。与相应杂多酸盐的紫外吸收光谱比较，形成标题化合物后，260 nm左右的紫外峰发生了红移，这可能是由于杂多阴离子与季铵阳离子之间的静电作用，使Ob/Oc→Mo荷移跃迁能降低，导致紫外吸收峰红移。这也进一步表明季铵盐与杂多酸确实发生了反应。

表2 复合物的IR数据Table 2 IR data of the complexes

表3 复合物的UV数据Table 3 UV data of the complexes

2.4 XRD分析

为了进一步确定所合成新化合物的结构，对标题化合物进行X-射线粉末衍射物相分析(图 2)。经典杂多酸分子在7°附近会出现特征峰[21]；由于取代金属元素钒的插入，特征峰衍射角度会出现一定位移，V取代以后，衍射强度在8°～9°处加强；C15H34NBr分子在 7°、11°、21°、25°处都有较强的衍射峰； 当复合材料形成以后， 在 7°、8°、9°、11°、21°、25°附近的衍射峰强度明显降低，说明杂多酸和C15H34NBr分子结构上发生了变化，新的物相生成。

2.5 热重分析

测试杂多酸、C15H34NBr和标题化合物热稳定性，表4列出杂多化合物的失重温度及失重率。采用NETZSCH STA 449F3型分析仪，升温速度10℃·min-1，测试温度范围为 20～700 ℃。

TG曲线是研究杂多酸化合物热稳定性的有力工具[22]。以磷钼矾杂多酸及C15H34NBr的TG曲线为例，PMo11V的TG曲线(图3)所示只有两步失重，20～400℃失去吸附水，484℃样品开始分解，可能是由于杂多酸分子结构发生变化，而C15H34NBr的失重温度范围为 200～283 ℃(图 3)，失重率为 96．47%，可见C15H34NBr在此温度范围内几乎全部失重。

C15H34NBr-PMo11V的TG曲线(图 3)所示，有三步失重。第一阶段失重为20～180℃，失重率为3．21%，这是由于材料失去了吸附水和结晶水。第二阶段的失重为200～430℃，失重率为 22．36%，认为是有机铵盐部分发生分解和失去结构水；第三步失重从490～698℃开始C15H34NBr-PMo11V的结构发生改变并部分分解，失重率为4．72%，认为是杂多酸发生了分解。经2至3步失重后，杂多酸铵盐基本失去了所有铵离子，其分解的最终产物为有杂多阴离子组成的氧化物。

表4 复合物的热性质Table 4 Thermal properties of the complexes

对比标题化合物和季铵盐之间的初始分解温度均为约200℃，阴离子置换后季铵盐的初始分解温度并未产生明显变化，但是杂多酸季铵盐的分解速度相对较慢，这对于该类抗菌材料用于木塑复合材料(最高成型加工温度约180℃)对耐热性有较高要求的场合是有重要意义。

2.6 形貌分析

目标产物的形貌用扫描电镜分析，结果如图4所示。由图4可以看出材料表现为微米棒形态，大多呈规则圆柱形，分布均匀。目标产物具有一定的钢性，聚合到一定长度后，由于重力的作用发生断裂，因此电镜照片显示出短的棒状形态。由图4、5可见，材料的微米棒直径相差不大。4种材料的形貌基本相同，表明合成的材料的刚性好。通过观察目标产物的透射电镜图6、7发现，材料晶粒呈片状，粒径均匀，而且分散性好，颗粒尺寸大约在100 nm左右。

3 抑菌性能测试

分别取0.5 g的C15H34NBr、杂多酸及终产物，涂抹与菌种培养皿上，每12 h观察一次，测量并记录抑菌圈直径与药品直径，并将其比值列表。药品编号如下：1 号:C15H34NBr；2 号：PMo11Fe；3 号：PMo11Co；4 号：PMo11V；5 号：C15H34NBrPMo11Fe；6 号：C15H34NBrPMo11Co；7 号：C15H34NBrPMo11V。

3.1 对金黄色葡萄球菌的测试

通过对金黄色葡萄球菌抑菌实验测得的数据分析可知，标题产物的相对抑菌直径大于杂多酸与季铵盐的相对抑菌直径。以C15H34NBrPMo11V为例，其相对抑菌直径为5．3，比PMo11V的3．3增到原来的1．6倍，那么其抑菌效果也提高到1．6倍。由表5中数据及图8、9可知，实验24 h与12 h的实验结果几乎没有差别，足以证明终产物的杀菌时间短、见效快、抑菌效果持久等优点。

3.2 对枯草芽孢杆菌的测试

对枯草芽孢杆菌的抑菌测试中，与测试1相似，C15H34NBrPMo11V的相对抑菌直径为PMo11V的2．9 倍，为 C15H34NBr的 2．2 倍。实验数据有力的说明了终产物的抑菌性能为杂多酸、季铵盐的2～3倍。

表5 复合物对金黄色葡萄球菌抑菌性的测试结果Table 5 Test results of complexes for the antimicrobial activity of Staphylococcus aureus

表6 复合物对枯草芽孢杆菌抑菌性的测试结果Table 6 Test results of complexes for the antimicrobial activity of Bacillus subtilis

表7 复合物对大肠杆菌的测试Table 7 Ttest results of complexes for the antimicrobial activity of Escherichia coli

3.3 对大肠杆菌的测试

对大肠杆菌的抑菌测试中，对比发现合成的目标产物的相对抑菌直径比C15H34NBr及相应的杂多酸都提高到原来的2～3倍，证明其抑菌性能一样也增强到2～3倍。

在三组测试实验中，目标产物的抑菌性均高与相应的多酸与季铵盐，24 h与12 h的实验结果没有差别，可见产物在12 h可以起到很好的抑菌效果，这表明杂多酸季铵盐具有杀菌见效快的优点。后续研究中将对其抑菌作用的持久性、环境适应性等性能进行评价。

4 结 论

本文采取立体选择法成功合成以过渡元素V、Fe、Co和Ni为取代原子的Keggin结构的取代型磷钼杂多酸盐，在水热条件下与十二烷基三甲基溴化铵进行反应，得到了4种新的基于Keggin型多酸阴离子和有机季铵阳离子的杂化材料，并通过FT-IR，UV-Visible、TG、XRD、SEM、TEM 等手段进行了结构表征。通过对细菌抑菌性能测试，证实了由于缺体取代型杂多酸的引入，季铵盐的抗菌性能提高到原来的2～3倍；通过对比表明，C15H34NBr-PMo11V的抑菌效果最好，可能是因为V的金属活泼性强于其他3种元素的原故。标题化合物具有杀菌时间短、见效快、抑菌效果持久等优点，这有助于拓展杂多酸与季铵盐在抗菌材料领域的应用范围。

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