HPLC 法测定不同产地硫熏和烘干金银花中绿原酸含量

邢志霞 崔燕兵 刘 伟

1.漯河医学高等专科学校，河南漯河 462002；2.河南中医学院分析测试中心，河南郑州 450008

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]，主要分布在山东、湖南、广东、河南、安徽、四川、陕西、贵州等地。味甘、性寒，为临床常用药，金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、解热抗炎、利胆保肝等多种药理作用。临床用于痈肿疖疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病热等症。主要成分为绿原酸、木樨草苷、挥发油等。关于金银花的产地加工，多数本草著作均在采后阴干。现代研究报道有硫磺熏晒法[2]、蒸晒、烘干，强制通风装置干燥[3-4]，微波干燥等。目前，关于金银花硫磺熏蒸及烘干以后有效成分定量分析报道不多，本次试验测定了硫磺熏蒸和烘干后金银花中绿原酸的含量，为产地加工后金银花药材的质量评价提供参考依据。

1 仪器与试药

DIONEX Summit 系统高效液相色谱仪，METTLER AE 240 十万分之一天平，FA2004A万分之一天平；所用乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯；绿原酸对照品（批号：110753-200212，中国药品生物制品检定所）；木犀草苷对照品（批号：111720-200603，中国药品生物制品检定所）；所用金银花药材由河南中医学院药学院董诚明教授鉴定为金银花（Lonicera japonica Thunb.）。烘干金银花采用40℃烘干5 h，再55℃，烘干10 h；硫磺熏蒸样品硫磺用量100 g/m3，熏蒸1次，熏蒸2 h，然后照上述方法烘干。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验[5-8]

AichromBond-AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相：0.4%磷酸溶液-乙腈=87∶13；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：327 nm；进样量 10 μL；理论塔板数不低于1 000。

2.2 对照品溶液的制备

分别取绿原酸、木犀草苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，分别加50%的甲醇制成1 mL 含40 μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

2.3 供试品溶液的制备

取金银花粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%的甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理功率（250 W，频率 35 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加50%的甲醇溶液至刻度，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察 精密量取“2.2”项下绿原酸对照品溶液 2、4、6、8 mL，用 50%的甲醇定容至 10 mL，摇匀，得到5个浓度的绿原酸对照品溶液。按上述色谱条件各进样10 μL，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品的量（X）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程：Y=6.028 6X-5.211 9，r=0.999 9，绿原酸在0.083 6～0.418 0 μg 范围内呈良好线性关系。色谱见图1。

2.4.2 精密度试验 精密吸取同一绿原酸对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录峰面积，其RSD=0.10%。提示仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批金银花样品0.5 g 共6份，精密称定，照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，测定绿原酸含量，其RSD值为1.34%。

2.4.4 稳定性试验 分别精密吸取供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、10、12、24 h 注入高效液相色谱仪，记录绿原酸峰面积，其RSD 为0.87%，表明样品中绿原酸在24 h 内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的金银花样品6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入定量绿原酸对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定回收率，结果见表1。

2.4.6 样品含量测定 精密吸取各批次供试品溶液10 μL按“2.1”项下色谱条件进样，以外标法计算各样品溶液中的绿原酸的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 关于硫磺熏蒸炮制方法的应用

硫磺熏蒸法作为一个传统的加工养护方法，一直在一些医院、生产企业和民间沿用。硫熏使中药材或中药饮片干燥快，不变质，不发霉，不虫蚀。该方法不仅改变药材外观，而且影响药材化学成分的变化，从而使药材的质量发生变化。在控制硫熏后二氧化硫残留量符合国家现行标准的情况下，该法作为新鲜金银花的加工方法有一定存在价值。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

表2 金银花中绿原酸含量测定结果（mg/g）

3.2 金银花不同炮制品中绿原酸的含量比较[9]

金银花含量测定结果可以看出，硫磺熏蒸后金银花中绿原酸的含量普遍比烘干品高，这可能是硫熏后金银花内部化学成分之间发生相互作用的结果，有待进一步研究。同一炮制方法中不同产地之间的差异较大，其中郑州产地金银花中绿原酸含量较低，封丘、山东两地含量较高，这可能与当地的土壤、气候等环境因素密切相关。各个产地金银花经两种方法炮制后，含量均在1.5%以上，符合《中国药典》2010年版规定。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：205.

[2]杨俊杰，豆成林，李娟，等.河南金银花产地深加工的探讨[J].时珍国医国药，2011，22（11）：2739-2740.

[3]辛华，丰杰，程若敏，等.HPLC 测定不同产地金银花中绿原酸和木犀草苷[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（2）：60-63.

[4]赵四清，曾嵘，雷鹏，等.熏硫加工对天麻饮汤剂质量的影响[J].湖南中医学院学报，2005，25（2）：25，37.

[5]孟晓岩，丁勇.高效液相色谱法同时对金银花中5 种有效成分的含量测定[J].实用药物与临床，2012，15（2）：93-94.

[6]杨蓓蓓，刘超，王素娟，等.高效液相色谱法测定金银花药材中3 种成分的含量[J].药物分析杂志，2006，26（2）：168-171．

[7]陈钢，侯世祥，胡平，等.金银花提取物中绿原酸的稳定性研究[J]中国中药杂志，2003，28（3）：223-225.

[8]时军波，徐娜，刘长安，等.金银花不同部位中绿原酸和木犀草苷含量的测定[J]化学分析计量，2010，19（6）：45-47.

[9]马晓青，蔡皓，刘晓，等.硫磺熏蒸前后金银花的HPLC 指纹图谱比较和聚类分析[J].中国新药杂志，2012，21（1）：92-95.