基于AOTF-近红外光谱技术的川贝母药材即时快速鉴别研究

杨复森， 武卫红， 王 宁，*， 黄林芳， 董海平

(1.山东中医药大学，山东济南250002;2.山东医学高等专科学校，山东济南250002;3.中国医学科学院药用植物研究所，北京100193;4.济南金宏利实业有限公司，山东济南250100)

贝母为临床常用药，具清热散结，化痰止咳功效。2010年版《中国药典》［1］收载贝母类药材包括川贝母、浙贝母、伊贝母、平贝母和湖北贝母共5大类。收载川贝母的基原植物共6种［1］，即川贝母Fritillaria cirrhosa D．Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K．C．Hsia、甘肃贝母Fritillaria przewalskii Maxim、梭砂贝母 Fritillar delavayi Franch、太白贝母Fritillaria taipaiensis P．Y．Li和瓦布贝母 Fritillaria unibracteata Hsiao et K．C．Hsia var．wabuensis(S．Y．Tang et S．C．Yue)Z．D．Liu，S．Wang et S．C．chen，其药材按照性状不同分别习称“松贝” “青贝” “炉贝”和“栽培品”。

川贝母临床用药历史悠久、疗效确切，但正品川贝母资源匮乏，价格昂贵，在实际应用中存在两大问题:一是贝母类药材均来源于百合科植物的干燥鳞茎，贝母属植物分布广泛，种间变异复杂外形相似，给川贝母的基原鉴定带来极大困难;二是川贝母商品主要规格“松贝”中常掺杂价格低廉的平贝母、东贝母和珠贝等［2］，存在以次充好、以假乱真的问题。而现行的检测方法中无论传统鉴别方法还是现代研究技术 (薄层色谱法、HPLC法、热分析法、分子鉴定法［3］等)均存在操作繁琐，分析周期长，难以适时应用于现场快速检测的问题，因此，目前亟待建立在流通领域中对川贝母的现场即时快速鉴别方法，以规范川贝母药材市场及保证临床用药的安全有效。

便携式声光可调滤光器 (AOTF)-近红外光谱仪克服了传统车载近红外光谱仪的缺点，为在现场适时作业提供了可能，近年来应用于中成药、烟草、化工等分析领域［4-5］。本研究基于AOTF-近红外光谱技术，结合化学计量学方法建立了川贝母基原鉴别方法及商品“松贝”的快速识别方法，获得了满意结果。

1 仪器和材料

1.1 仪器 Luminar 5030型便携式AOTF近红外光谱仪 (美国BRIMROSE公司)，包括:Snap!光谱采集软件和The Unscrambler分析软件 (挪威CAMO公司);YF111型高速中药粉碎机 (浙江省瑞安市永历制药机械有限公司)。

1.2 样品 多数收集自各贝母主产地，少数购于药材市场，详见表1，样品经中国医学科学院药用植物研究所黄林芳教授和山东大学药学院赵华英教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 近红外光谱采集与预处理 将所有样品置于恒温干燥箱内60℃干燥12 h后，粉碎，过80目筛，分别采集光谱，取约5 g粉末置于样品槽，用盒盖将样品表面刮平，加盖一起置于支架上，将光谱仪的探头垂直卡在样品盒盖的圆孔处。仪器参数设置:波长范围1 100～2 300 nm、波长增量2.0 nm、扫描次数300;每个样品重复测量3次，取平均光谱。所测近红外光谱见图1。

为了消除基线漂移的影响，提高分辨率和灵敏度，经比较本研究采取一阶微分处理光谱数据效果较好，同时选择平滑数为9，可达到理想效果。图2为预处理后的吸收光谱图。

2.2 主成分分析法快速鉴别川贝母 主成分分析法 (PCA)是一种简化数据结构、突出主要矛盾的多元分析方法，被广泛应用在化学与测谱学分析中［6］。本研究首先利用该方法对所有贝母类药材进行分析，将预处理后的光谱数据导入The Unscrambler分析软件，进行PCA运算，结果以空间分布图表示，见图3。从川贝母6个基原品种中各随机选取1批，共6批作为阳性验证集样本，其余50批为建模集样本，7种非贝母类药材中各随机选取2批，共14批作为阴性验证集样本，继续利用PCA分析方法建立川贝母类药材的分析模型，并对验证集进行验证，结果见图4。验证结果可采用两种表示方法:一是Excel表格显示法，二是模型区域判别法，如图4左侧表格中，如果样品编号后是空白，说明该样品被检测为不属于模型内样品，如果样品编号后有*号标记，说明该样品被检测为属于模型内的样品;图4右侧是模型分布区域图，如果被检测样品x落在分析模型区域内，说明该样品属于川贝母，反之，说明被检测的样品与建模样品不相同，不是川贝母。

表1 贝母样品Tab.1 Samples of Fritillaria

图1 川贝母及其他贝母品种的近红外原始吸收光谱图Fig.1 Raw NIR absorption spectrum of Fritillariae cirrhosae Bulbus and other Fritillaria varieties

图2 川贝母及其他贝母品种的近红外一阶导数吸收光谱图Fig.2 First-order derivative NIR absorbance spectrum of Fritillariae cirrhosae Bu lbus and other Fritillariae species

图3 贝母类药材的PCA空间分布图Fig.3 PCA spatial distribution map of Fritillaria

图4 川贝母分析模型对非川贝母类药材验证图Fig.4 Validation figures on the non-Fritillariae cirrhosae Bulbus confirmed by Fritillariae cirrhosae Bulbus analysismodel

图3中所示样品前3个主成分的累计方差贡献率为97%，能够代表原近红外光谱的主要信息。由样品的空间分布情况可知，川贝类药材 (川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、瓦布贝母和太白贝母)空间分布区域集中，聚为一类，而其他贝母药材 (平贝、伊贝、浙贝、东贝、湖北贝母和安徽贝母)有各自相对集中的聚集区，且各聚集区与川贝类专属区有一定的距离，能够进行明确的区域识别。图4显示川贝母分析模型可将川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、瓦布贝母和太白贝母正确判别为与建模样品相同的川贝母类药材，而平贝、伊贝、浙贝、东贝、湖北贝母和安徽贝母则判为非模型内药材，即不是川贝母。综上说明该方法可将川贝母类药材与非川贝类药材有效区别开来。

2.3 基于暗紫贝母的6种基原川贝母品种定性分析 “松贝”是商品川贝母的主要规格，而暗紫贝母是松贝的主要来源［7］，从收集到的28批暗紫贝母中随机选取5批作为阳性验证集样本，剩余23批为建模集样本，其他5种基原川贝母中各随机选取3批，共15批作为阴性验证集样本，利用PCA分析法建立了暗紫贝母的近红外定性分析模型，并利用该模型对验证集进行验证，其结果见图5。

图5 暗紫贝母定性分析模型对6种基原川贝母的验证结果Fig.5 Results on Fritillaria unibracteata qualitative model for verifying Fritillariae cirrhosae Bulbus from six sources

图中显示，阳性验证集均落在模型区内，说明其与建模样品相同，可被模型正确判别为暗紫贝母，模型的准确判别率较高。阴性验证集中川贝母、梭砂贝母、太白贝母全部落在模型区外，说明该验证集样品与建模样品不相同，可被模型正确排除。而阴性验证集瓦布贝母、甘肃贝母则各有两批落在模型区外，一批落在模型区内，说明二者易被误判为暗紫贝母。有研究者认为瓦布贝母为暗紫贝母的变种［8］，而甘肃贝母和暗紫贝母的亲缘关系十分密切［9］，这可能是二者被模型误判的根本原因。

由图5的分布情况还可看出，瓦布贝母与甘肃贝母离暗紫贝母分布区最近，川贝母次之，太白贝母和梭砂贝母最远，可推测瓦布贝母、甘肃贝母与

暗紫贝母的亲缘关系最近，川贝母次之，太白贝母和梭砂贝母与暗紫贝母的亲缘关系最远，该结果与李庆等［3］通过遗传聚类分析方法研究报道结果一致。图中还显示太白贝母和梭砂贝母空间分布区域有交叉，也许是二者亲缘关系接近的表现，这一结果还需深入研究。

2.4 “松贝”与其混伪品的快速鉴别 “松贝”价格高、资源少，药材市场多见以“小平贝”、“珠贝”、 “小东贝”混充松贝。本研究利用PCA分析法建立了25批松贝 (暗紫贝母为其主要来源)的近红外定性分析模型，经对3批松贝作阳性验证，结果准确，模型的判别能力良好。调用松贝模型对小平贝 (8批)、珠贝 (2批)、小东贝(2批)作验证，结果见图6。

图6 松贝定性分析模型对其混伪品的验证结果Fig.6 Verification results of qualitative analysis of"F．sungbei Hsiao et K．C．Hsia"on its adulterants

结果显示，小平贝、珠贝和小东贝均落在所建模型区之外，说明验证集样品与建模样品不相同，可被模型正确排除，即不是松贝。

3 小结与讨论

3.1 近红外光谱具有全息性特点，可反映被测对象的物理、化学性质甚至生物学属性［10］，而AOTF-NIR光谱仪的便携性又增加了其现场快速分析的优势，本研究借助PCA分析法，从对川贝母群的识别、川贝母群内不同基原品种的定性分析及商品“松贝”与伪品之间的鉴别三个角度进行了初步探讨研究，结果较理想，为实现川贝母现场即时快速检测方法的建立提供了借鉴。

3.2 由于贝母为多年生植物，种植方式多样 (包括种子和鳞茎)，造成不同年限、不同种植方式、不同采收期鳞茎性状有差异，所以若想将该技术应用于实际工作中，PCA分析模型的建立是关键，需要通过收集大批量的药材，扩大建模集的数量，得到更为准确和完善的川贝母定性分析模型，从而扩大其应用范围。

3.3 2005年版《中国药典》收载川贝母共四种基原植物，分别为川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母。由于川贝母资源短缺，2010年版《中国药典》新增了太白贝母与瓦布贝母作为川贝母的基原植物，从本实验研究结果来看，新增的两个基原与原来的四个基原贝母药材在PCA空间分布图中能够很好的聚为一类，属于川贝母群，可见他们在理化性质方面极为相近，表现为较近的亲缘关系，与文献［11-13］研究结果一致，进一步说明《中国药典》新增二者为川贝母的基原是科学合理的。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2010年版一部［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:34.

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