酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工艺研究

王兆丰， 张 继， 武伟国， 于 佳

(西北师范大学生命科学学院，甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心，甘肃兰州730070)

茶多酚是一种性能优良的天然食品添加剂和效果显著的医药保健品，应用领域十分广阔［1］，我国于1990年制定了相应的国家标准，开始在食品工业、医药行业和日用化工业等领域广泛地应用［2］。研究表明，茶多酚安全无毒，具有清除自由基、抗氧化、抗艾滋病、抑制肿瘤、抑制乙肝病毒和调节免疫力等作用，对人体多种病症的预防与治疗起着重大作用［3-5］。茶多酚的主要成分是儿茶素类，同时含有少量咖啡因。咖啡因能促进人体生热和脂肪氧化，刺激中枢神经系统兴奋［6］，具有强心、利尿的作用，但过量摄取可能产生失眠、堕胎或流产、神经过敏等有害作用［7］。因此，茶多酚中的咖啡因量决定了茶多酚的应用范围，在医药保健领域，咖啡因质量分数要求低于1%，在其它应用领域对咖啡因量又有着特殊的要求［8］。普通商品茶多酚中咖啡因质量分数为2%～10%，远高于茶叶中的咖啡因量。人们一直在探索从茶多酚中脱除咖啡因的方法，常用的有层析法、吸附法、离子沉淀法、有机溶剂或超临界CO2萃取法和微生物或酶降解法等，其中吸附法相对应用较广。咖啡因具有多羟基嘌呤环和共轭双键，易被多孔性物质 (如活性炭、硅藻土、活性黏土和纤维素等)所吸附，酸性白土主要指玻璃质火山岩分解后的产物，其主要化学成分是Al2O3、SiO2、水及少量铁、镁、钙等，无可塑性，具有多孔性和较强吸附性，吸水后不膨胀。本实验使用酸性白土，探究其脱除茶多酚中咖啡因的最佳工艺条件。

1 材料、试剂及仪器

1.1 材料 陇南夏秋茶叶:甘肃康县茗芝茶叶有限公司，粉碎，过60目筛。

1.2 试剂 没食子酸 (GA，≥98%)、儿茶素 (C，≥98%)、表儿茶素 (EC，≥98%)、表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG，≥99%)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG，≥98%)、表儿茶素没食子酸酯 (ECG，≥98%)和咖啡因 (CAF，99.2%)等对照品购自Aladdin Chemistry Co．Ltd。甲醇、乙酸为色谱纯，购自天津市凯信化学工业有限公司。乙腈为色谱纯，购自Fisher ChemAlert;超纯水;酸性白土购自辽宁省义县石油白土厂。

1.3 仪器 MG08S-2B微波试验仪 (南京汇研微波系统工程有限公司);ML-902定时恒温磁力搅拌器 (上海浦江分析仪器厂);N-1001旋转蒸发仪 (上海爱郎仪器有限公司);优普超纯水机 (成都超纯水科技有限公司);TDL5M台式大容量冷冻离心机 (湘仪离心机仪器有限公司);LGJ-18S冷冻干燥机 (北京松源华兴科技发展有限公司);AW 320电子天平 (Shimdzu Corporation);Ultimate 3000戴安分析型高效液相色谱仪 (美国戴安公司);AP-01P真空泵 (天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

2 方法

2.1 茶多酚中咖啡因和儿茶素类的测定 用高效液相色谱法 (HPLC)定量测定茶多酚中的咖啡因和儿茶素类。测定条件如下:AT．Lichrom ODS色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);乙腈-乙酸-水 (9∶0.5∶90.5)为流动相A，乙腈-乙酸-水 (80∶0.5∶19.5)为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;柱温35℃;检测波长278 nm。

表1 色谱条件

标准曲线 分别称取没食子酸3.0 mg、儿茶素10.0 mg、表儿茶素10.0 mg、表没食子儿茶素没食子酸酯30.0 mg、没食子儿茶素没食子酸酯15.0 mg、表儿茶素没食子酸酯25.0 mg和咖啡因5.0 mg至100 mL量瓶中，10%乙腈溶解后定容至刻度，配成没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和咖啡因的质量浓度分别为30、100、100、300、150、250、50 mg/L的混合溶液，用0.45μm滤膜过滤，即得儿茶素类和咖啡因的对照品混合溶液。移取1.0 mL儿茶素类和咖啡因的对照品混合溶液，梯度稀释至0、2、4、6、8、10倍。准确吸取20μL儿茶素类和咖啡因对照品的混合溶液的稀释液，在Ultimate 3000戴安分析型高效液相色谱仪上进行检测，以对照品质量浓度X(mg/L)为横坐标，相应的色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程。

测定茶多酚中咖啡因和儿茶素类的量 精确称取0.01 g茶多酚于10 m L量瓶中，10%乙腈溶解后定容至刻度，用0.45μm滤膜过滤，即得茶多酚的样品溶液。精密吸取20μL茶多酚的样品溶液，在Ultimate 3000戴安分析型高效液相色谱仪上进行检测，根据标准曲线和测得的色谱峰面积计算茶多酚中咖啡因和儿茶素类的量。

2.2 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的技术路线 将茶叶用粉碎机粉碎，过60目筛。准确称取茶末6.0 g，加超纯水120 mL，于MG08S-2B微波试验仪中80℃浸提60 min，微波辐照功率600 W［9］。对提取液立即进行减压抽滤，滤液即为茶多酚提取液。准确量取100 mL茶多酚提取液，加入3.0 g酸性白土，120 r/min机械搅拌下吸附3次，每次40 min。吸附后的茶多酚提取液于TDL5M冷冻离心机上4 000 r/min离心10 min，上清液于N-1001旋转蒸发仪上浓缩，将浓缩液置于预先称定质量的培养皿上，于LGJ-18S冷冻干燥机上干燥即可。称定培养皿质量并计算茶多酚质量，按2.1项中的方法测定咖啡因及儿茶素类的量。

2.3 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工艺优化

2.3.1 单因素试验 考察酸性白土用量、吸附时间、吸附次数和搅拌速率对酸性白土吸附茶多酚中咖啡因效果的影响。单因素试验设计如下:(1)酸性白土用量:酸性白土用量10、20、30、40、50 g/L，吸附时间20 min，吸附次数1次，搅拌速率120 r/min;(2)吸附时间:酸性白土用量30 g/L，吸附时间20、40、60、80、100 min，吸附次数1次，搅拌速率120 r/min;(3)吸附次数:酸性白土用量30 g/L，吸附时间40 min，吸附次数1、2、3、4、5次，搅拌速率120 r/min;(4)搅拌速率:酸性白土用量30 g/L，吸附时间40 min，吸附次数3次，搅拌速率40、80、120、160、200 r/min;

2.3.2 正交试验 在单因素试验的基础上，设计4因素3水平L9(34)正交试验，因素及水平见表2。

表2 正交试验因素水平

2.4 数据处理 每个数据平行3次实验，数据用SpssStatisticsV 17.0进行统计学处理，结果以“均值±标准差”的形式表示。采用最小显著差异法 (LSD)对不同组数据进行单因素方差分析，显著性水平α取0.05。

3 结果与讨论

3.1 咖啡因和儿茶素类的标准曲线 儿茶素类和咖啡因的标准曲线的回归方程及相关系数见表3。

表3 线性回归方程和相关系数

3.2 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工艺优化

3.2.1 酸性白土用量对咖啡因吸附效果的影响 如图1所示，当酸性白土用量为10、20、30 g/L时，咖啡因量依次显著降低 (P＜0.05)。当酸性白土用量为30 g/L时，与40、50 g/L时相比，咖啡因量无显著变化 (P＞0.05)，但茶多酚质量却显著减小 (P＜0.05)，故选30 g/L为适宜的酸性白土用量。

3.2.2 吸附时间对咖啡因吸附效果的影响 如图2所示，当吸附时间为20、40 min时，咖啡因量依次显著降低 (P＜0.05)。当吸附时间为40 min时，与60、80 min时相比，咖啡因量无显著变化 (P＞0.05)，茶多酚质量却显著减小

图1 酸性白土用量对咖啡因量和茶多酚质量的影响(P＜0.05)，故选40 min为适宜的吸附时间。

图2 吸附时间对咖啡因量和茶多酚质量的影响

3.2.3 吸附次数对咖啡因吸附效果的影响 如图3所示，当吸附次数为1、2和3次时，咖啡因量依次显著降低(P＜0.05);当吸附次数为3次时，与4和5次相比，咖啡因量无显著变化 (P＞0.05)，茶多酚质量却显著减小 (P＜0.05)，故选3次为适宜的吸附次数。

图3 吸附次数对咖啡因量和茶多酚质量的影响

3.2.4 搅拌速率对咖啡因吸附效果的影响 如图4所示，当搅拌速率为40、80、120 r/min时，咖啡因量依次显著降低 (P＜0.05)。当搅拌速率为120 r/min时，与160、200 r/min时相比，咖啡因量无显著变化 (P＞0.05)，茶多酚质量亦无显著变化 (P＞0.05)。故选120 r/min为适宜的搅拌速率。

3.2.5 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的正交试验 为了更好地分析各个因素对茶多酚提取液中咖啡因脱除效果的影响，按表2的设计进行正交试验，以确定最经济最有效的工艺方案。正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。

图4 搅拌速率对咖啡因和茶多酚质量的影响

表4 吸附条件正交试验结果

表5 正交试验方差分析

由表4可知，4个因素对咖啡因量影响作用的大小顺序为C＞A＞D＞B，即吸附次数＞酸性白土用量＞搅拌速率＞吸附时间，正交试验优化的酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工艺条件为A3B2C3D3，即酸性白土用量40 g/L、吸附时间60 min、吸附次数3次和搅拌速率160 r/min。由表5可知，4个因素中只有吸附次数对咖啡因量影响显著 (P＜0.05)。

单因素试验得到的最佳工艺条件为A2B1C3D2，正交试验得到的最佳工艺条件为A3B2C3D3，为验证可选方案，以未吸附组为对照，作验证实验以比较这两个方案的优劣。结果表明，对照组、单因素优化组和正交优化组对应的茶多酚质量分别为 (1.121±0.004)g、(1.058±0.002)g和(1.021±0.002)g，咖啡因质量分数分别为 (3.68±0.25)%、(0.06±0.01)%和 (0.04±0.01)%。单因素优化组或正交优化组与对照组相比，茶多酚质量和咖啡因量均显著减小或降低 (P＜0.05)，正交优化组与单因素优化组相比，咖啡因量无显著变化 (P＞0.05)，茶多酚质量却显著减小 (P＜0.05)。综上，从经济、简便、省时和高效的角度考虑，优先选用单因素试验得到的最佳工艺条件A2B1C3D2。

3.3 酸性白土吸附咖啡因对茶多酚中各组分的影响 未吸附组和吸附组对应的茶多酚的高效液相图和咖啡因与儿茶素类的量分别如图5和表6所示。

图5 对照品 (A)和脱咖啡因茶多酚 (B)的高效液相色谱图

表6 脱咖啡因前后茶多酚组分的变化

结果表明，酸性白土对茶多酚中咖啡因的脱除效果十分显著，未吸附组茶多酚中咖啡因质量分数为 (3.68±0.25)%，而吸附组降为 (0.06±0.01)%，咖啡因脱除率达98.25%;未吸附组茶多酚中最主要的儿茶素类是表没食子儿茶素没食子酸酯，儿茶素类的量由高到低依次是表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子酸和儿茶素。吸附组茶多酚中儿茶素类的量均有所提高，这是因为酸性白土吸附咖啡因后，咖啡因量的显著降低引起了儿茶素类相对含有量的提高，其提高次序由高到低依次是儿茶素、表儿茶素、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯，酯型儿茶素表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的质量分数分别提高了12.26%和8.23%;表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯为同分异构体，未吸附组茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯的量之比为2.28，吸附组茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯的量之比为2.49，两者之间无显著差异 (P＞0.05)，说明酸性白土脱除茶多酚中的咖啡因后，表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯之间没有发生明显的同分异构转化。

王瑞芳等［10］研究表明，弱极性吸附树脂RX-2对绿茶提取液中的咖啡因具有较高的吸附容量和吸附选择性，动态吸附时发生层析分离，是一种较为理想的咖啡因脱除剂，经两级树脂纯化后，咖啡因量降至0.2%以下。岳鹏翔等［11］对绿茶浓缩液中咖啡碱的超临界CO2萃取工艺进行了研究，结果表明，超临界CO2萃取技术能有效地脱除绿茶浓缩液中的大部分咖啡因，咖啡因脱除率为84.26%。王平等［12］探讨了活性炭吸附脱除茶叶提取液中咖啡因的最佳工艺条件，结果表明，在最优条件下咖啡因质量分数降为0.18%。与上述脱除咖啡因的方法相比，该法具有更高的咖啡因脱除率 (98.25%)，咖啡因质量分数降为 (0.06±0.01)%，而且避免了有机溶剂残留、设备投资高和工艺复杂等弊端。

4 结论

本实验通过单因素及正交试验对酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工艺进行了优化，结果显示，酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的最佳工艺条件为酸性白土用量30 g/L、吸附时间40 min、吸附次数3次和搅拌速率120 r/min，这几个因素对咖啡因量影响作用的大小顺序为吸附次数＞酸性白土用量＞搅拌速率＞吸附时间，且吸附次数对咖啡因量影响显著 (P＜0.05)。此外，酸性白土吸附茶多酚中的咖啡因后，咖啡因量由 (3.68±0.25)%下降为 (0.06±0.01)%，咖啡因脱除率达98.25%，儿茶素类活性物质的量均有所提高，且表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯之间未发生明显的同分异构转化。

综上，酸性白土吸附法能够有效地脱除茶多酚中的咖啡因，且与其它方法相比，茶多酚中咖啡因的脱除率更高，儿茶素类活性物质未有损失，且操作简便，成本低廉，安全无毒，省时高效，有利于工业化生产，是一种值得推广的方法。

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