氧化乐果对大鼠体内氧化应激和脂代谢水平的影响

潘奇正 侯 雪 时佳宏 吕京懋 王 清 孙景春

(吉林大学中日联谊医院麻醉科，吉林 长春 130021)

有机磷农药是目前我国使用最多的农药，有机磷酸酯类化合物极易溶解于油脂中并且很少或基本不溶解于水中，易经呼吸道、消化道及皮肤吸收进入机体内。急性有机磷中毒的主要机制是胆碱酯酶抑制学说，有机磷可抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使机体内积累的乙酰胆碱持续、过度地刺激神经系统〔1～3〕。同时由于其良好的脂溶性，有利于其与细胞膜的相互作用，并导致磷脂双分子层结构的改变，并增强活性氧簇(ROS)的生成量〔4〕;从而破坏机体的氧化系统和抗氧化系统的平衡〔5〕，导致机体发生氧化应激，引起多种疾病如糖尿病、肿瘤的发生发展〔6，7〕;对健康的毒性作用也是极大的，如神经毒性、生殖毒性、心血管毒性、内分泌毒性等。目前关于氧化乐果对大鼠脂代谢影响的研究未见报道，机制也不清楚，本实验观察氧化乐果对大鼠体内氧化应激水平及脂代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 雄性Wistar大鼠40只，体质量为180～200 g，购于吉林大学基础医学院实验动物中心(合格证号:2007-003)。氧化乐果，购自河北新兴化工有限责任公司。丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、过氧化氢酶(CAT)测试盒及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒购自南京建成生物工程研究所;甲醇、正丁醇及氢氧化钾等试剂购自北京化工厂。

1.2 实验分组和给药 适应性喂养大鼠后，随机分为正常对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组各10只。低剂量组、中剂量组和高剂量组每天分别给予1/20、1/10、1/5 LD50的氧化乐果，正常对照组给予生理盐水。采用灌胃的途径给药，每日灌胃一次，连续给药2个月。每隔2 d称量一次大鼠体质量。

1.3 血清样本的采集 连续给药2个月后，大鼠眼球取血，4℃静置1 h，4 000 r/min，离心 15 min，取上清液，分装，－80℃保存待测。

1.4 MDA含量测定 采用硫代巴比妥酸反应比色法，脂质过氧化作用产生的MDA可与硫代巴比妥酸形成粉红色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4-酮)，三甲川在 534 nm 处有一吸收高峰，利用在534 nm处的消光系数即可计算出组织中MDA的含量。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 SOD测定 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(·)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出组织中的SOD活力。严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 CAT测定 CAT分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405 nm处测定其生成量，通过计算可测得CAT的活力。严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 GSH-Px测定 GSH-Px可以促进H2O2与还原型谷胱甘肽(GSH)反应，生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH-Px的活力可以用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中GSH的消耗，可计算出GSH-Px的活力。同时GSH可以与二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子，呈黄色，在412 nm处测其吸光度即可计算出GSH的量。由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算此酶的活力时，必须扣除非酶反应引起的GSH减少。严格按照试剂盒说明书进行。

1.8 TG、TC和LDL含量测定 取大鼠血清200 μl，应用全自动生化分析仪测定大鼠血清中TG、TC、LDL和HDL含量。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化 随着氧化乐果暴露时间的持续，低剂量、中剂量和高剂量组大鼠体质量增加量减少。给药2个月时，与正常对照组相比，低剂量、中剂量和高剂量组大鼠体质量显著降低(P＜0.05);高剂量组大鼠体重明显低于低剂量组和中剂量组(P＜0.05)。见图1。

图1 氧化乐果连续给药2个月大鼠的体重变化

2.2 氧化乐果对各组大鼠血清抗氧化物酶活性的影响 与正常对照组相比较，低剂量、中剂量和高剂量组大鼠SOD、CAT和GSH-Px活性显著升高(P＜0.05)，高剂量组大鼠SOD和CAT活性显著高于低剂量和中剂量组(P＜0.05)。见表1。

表1 氧化乐果对各组大鼠血清抗氧化物酶活性的比较(±s ，U/ml，n=10)

表1 氧化乐果对各组大鼠血清抗氧化物酶活性的比较(±s ，U/ml，n=10)

组别SOD CAT GSH-Px正常对照组1.89±0.04 6.33±0.92 189±3.9低剂量组 1.57±0.04 3.17±0.34 178.3±5.34中剂量组 1.19±0.05 2.04±0.27 142±7.45高剂量组0.83±0.03 0.83±0.33 135.9±9.04

2.3 氧化乐果对各组大鼠脂代谢水平的影响 与正常对照组相比，中剂量和高剂量组大鼠血清TG、TC和LDL含量显著升高(P＜0.05)，HDL含量显著降低(P＜0.05)。与中剂量组相比，高剂量组大鼠血清 TG、TC和 LDL含量显著升高(P＜0.05)，HDL含量显著降低(P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠脂代谢水平比较(n=10，±s，mmol/L)

表2 各组大鼠脂代谢水平比较(n=10，±s，mmol/L)

与正常对照组比较:1)P＜0.05;与中剂量组比较:2)P＜0.05

组别TG TC LDL HDL正常对照组 0.32±0.015 0.94±0.071 0.27±0.026 1.07±0.035低剂量组 0.35±0.020 0.90±0.052 0.24±0.031 0.96±0.045中剂量组 0.51±0.0261) 1.11±0.0421) 0.38±0.0221) 0.77±0.0131)高剂量组 0.72±0.0231)2)1.36±0.0551)2)0.49±0.0311)2)0.63±0.0671)2)

2.4 氧化乐果对各组大鼠血清MDA水平的影响 与正常对照组〔(456.45±10.23)mmol/L〕相比较，低剂量、中剂量和高剂量组大鼠 MDA水平〔(523.5±15.3)、(553.4±12.4)、(614.6±9.99)mmol/L〕显著升高(P＜0.05)，高剂量组大鼠MDA水平显著高于低剂量和中剂量组(P＜0.05)。

3 讨论

氧化乐果是一种脂溶性分子，其可以很容易通过细胞膜进入细胞质中，一旦进入可导致各种组织细胞的高度损伤。研究表明，氧化乐果可显著引起脂质过氧化，增强ROS的生成〔8〕。ROS主要攻击生物分子，而脂质对ROS的攻击最为敏感〔9〕，膜脂的过氧化是组织损伤中一个不可避免的过程，而这有可能损害抗氧化的防御系统，导致氧化与抗氧化平衡的改变〔10〕。众所周知，ROS会导致细胞毒性〔11〕。而这一现象可通过观察脂质过氧化反映出来〔12〕。MDA是脂质过氧化过程中不饱和脂肪酸的分解产物，对MDA的测定可以明确反映脂质过氧化的程度〔13〕。抗氧化酶是调节机体ROS大量产生的重要酶类，在机体抵抗氧化应激的过程中，第一个关键酶是SOD，SOD可催化超氧阴离子(·)与H+的反应，使其转化为过氧化氢(H2O2)〔14〕;第二个关键酶 CAT催化 H2O2分解为 H2O和，同时 GSH-Px 也参与到分解 H2O2的反应中〔16〕，GSH-Px可以促进H2O2与GSH反应，生成H2O及GSSG，尤其在较低浓度的 H2O2下〔17〕，GSH-Px是抗氧化应激的核心〔18〕。本实验研究发现长期接触氧化乐果能够导致机体发生脂质过氧化，并且机体的抗氧化防御系统被破坏，主要表现在 SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化物酶活性降低。有研究表明有机磷农药马拉硫磷暴露的大鼠血脂异常，HDL水平降低，LDL水平增高〔19〕。

1 Sharma Y，Bashir S，Irshad M，et al.Effects of acute dimethoate administration on antioxidant status of liver and brain of experimental rats〔J〕.Toxicology，2005;206:49-57.

2 贺红武.有机磷农药产业的现状与发展趋势〔J〕.世界农药，2008;30(6):29-33.

3 Jintana S，Sming K，Krongtong Y，et al.Cholinesterase activity，pesticide exposure and health impact in a population exposed to organophosphates〔J〕.Int Arch Occup Environ Health，2009;82:833-42.

4 Videira RA，Madeira MC，Lopes VI，et al.Changes induced by malathion，methylparathion and paration，on membrane lipid physicochemical properties，correlate with their toxicity〔J〕.Biochim Biophys Acta，2001;1511:360-8.

5 Abdollahi M，Ranjbar A，Shadia S，et al.Pesticides and oxidative stress:a review〔J〕.Med Sci Monitor，2004;10(6):144-7.

6 Shadnia S，Azizi E，Hosseini R，et al.Evaluation of oxidative stress and genotoxicity in organophosphorus insecticide formulators〔J〕.Human Experim Toxicol，2005;24(9):439-45.

7 李建会，李 云，任治兴，等.黄芪联合胰岛素对糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用及其机制〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2013;39(2):246-50.

8 Amara IB，Soudani N，Troudi A，et al.Dimethoate induced oxidative damage and histopathological changes in lung of adult rats:modulatory effects of selenium and/or vitamin E〔J〕.Biomed Environ Sci，2012;25(3):340-51.

9 Barski D，Spodniewska A.Activity of selected antioxid ative enzymes in rats exposed to dimethoate and pyrantel tartrate.Polish〔J〕.J Veter Sci，2012;15(2):239-45.

10 Banerjee BD，Pasha ST，Hussain QZ，et al.A comparative evaluation of immunotoxicity of malathion after subchronic exposure in experimental animals〔J〕.Indian J Exp Biol，1988;36:273-82.

11 Slater TF.Free radical mechanism in tissue injury〔J〕.Biochem J，1984;222:1-15.

12 Debnath D，Mandal TK.Study of quinalphos formulation-induced damage of the testicular tissues and antioxidant defense systems in Sprague-Dawley albino rats〔J〕.J Appl Toxicol，2000;20:197-204.

13 Mandal TK，Das NS.Quinalphos induced oxidative stress and histoarchitectural alteration in rat testis〔J〕.Toxicol Int，2004;11:93-102.

14 Yim MB，Chock PB，Stadtman ER.Enzyme function of copper，zinc superoxide dismutase as a free radical generator〔J〕.J Biol Chem，1993;268:4099-105.

15 Scibior D，Czeczot H.Catalase:structure，properties，functions〔J〕.Postepy Hig Med Dosw，2006;60:170-80.

16 Malmezat T，Breuillé D，Capitan P.Glutathione turnover is increased during the acute phase of sepsis in rats〔J〕.J Nutr，2000;130:1239-46.

17 Lledias F，Rangel P，Hansberg W.Oxidation of catalase by singlet oxygen〔J〕.J Biol Chem，1998;273:10630-7.

18 Mates JM，Perez-Gomez C.Antioxidant enzymes and human diseases〔J〕.Clin Biochem，1999;32:595-603.

19 Rett K.The relation between insulin resistance and cardiovascular complications of the insulin resistance syndrome〔J〕.Diabet Obes Metab，1999;1(1):8-16.