生精冲剂对白消安致生精障碍大鼠恢复精子发生及其机理的研究

王庆忠，王东方，刘慧莲，冯道俊，王汉海，郭祖宝

潍坊学院生物与农业工程学院山东省高校“生物化学与分子生物学”重点实验室，潍坊 261061

精子发生是指从原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCSs)增殖、迁移、分化，一直到发育为成熟精子的整个过程［1，2］。这一过程受到遗传、激素、生长因子和环境等多种因素的影响［3］。据统计，全球15%的不育人口中，男性不育占50%［4］，70%不育男子的精子常有缺失、稀少、无活力、形态异常等缺陷，但关于引起这些异常的分子机理的研究还较少［5］，导致治疗男性不育的困难。白消安(busulfan)对精子发生有损害作用，导致无精子症或少精子症。利用白消安制备生精障碍模型动物，已有大量的报道［6］。研究显示，在少精子症的治疗中，单纯的西药治疗效果并不及一些中药方剂［7，8］。在本研究中，我们根据报道的生精冲剂协定配方［8］，研究其对生精障碍模型大鼠精子发生的影响和作用机理，以便更好的利用中药资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠购于北京维通利华实验动物中心，合格证号:SCXK-京2002-0003。大鼠在本实验室饲养适应后，取5～6周幼年雄性大鼠30只随机分为正常组、药物组和对照组，每组各10只，体重190±20 g。

1.1.2 主要药品及试剂

L-谷胺酰胺、青霉素、链霉素、葡萄糖、碘化丙啶(propidium iodine，PI)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、多聚甲醛、Tween-20、Triton X-100、DABCO是triethylendianine公司产品;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、白消安等购自 Sigma公司。无菌生理盐水为北京双鹤药业股份有限公司产品。大鼠促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)试剂盒、大鼠黄体生成素(luteinizing hormone，LH)ELISA检测试剂盒和大鼠睾酮(testosterone，T)ELISA检测试剂盒是生研(上海)生物科技有限公司产品。限制性内切酶、T4连接酶购自Promega公司;TRIzol试剂购自 Gibco公司，superscriptTMIII逆转录酶是 Invitrogen公司产品，Tag DNA聚合酶为大连宝生物公司产品。生精冲剂协定处方中的中药紫河车、黄芪、枸杞子、菟丝子、仙灵脾、龟甲、砂仁、丹参购于同仁堂药店。中药在常温下清洗后，70℃下4 h烘干，混合研磨成粉，过200目筛，包装后经Co60辐射灭菌。

1.2 实验方法

1.2.1 动物处理

正常组的大鼠常规饲养。药物组和对照组大鼠先制备成生精障碍大鼠，每只大鼠腹腔注射40 mg/kg体重白消安(白消安先以DMSO溶解后，注射前加等量的蒸馏水配制成4.0 mg/mL的浓度，并加温至35～40 ℃)［9］，1 次/周 ×2。处理 4 ～5 周后，内源性精子发生已经基本消除。此后，药物组的大鼠给予灌胃生精冲剂16 g/kg·d［8］，对照组大鼠灌胃等量生理盐水，连续30 d。

1.2.2 性激素水平的ELISA测定

停药后次日，断头处死大鼠取血，1500 rpm离心血液分离血清，用ELISA试剂盒测血清中FSH、LH和T水平。测定过程按说明书进行，主要步骤为:①在酶标包埋板上，分别设空白孔(不加样品和酶标试剂)、标准孔(加50 μL标准品)和样品孔(加40 μL样品稀释液和10 μL待测样品)，用封板膜封闭后，37℃瘟育30 min;②去封板膜，弃液体，用1∶30稀释的洗涤液30 s×5次，凉干;③加50 μL酶标试剂(空白孔除外)，37℃瘟育30 min;④用1∶30稀释的洗涤液30 s×5次，凉干;⑤加50 μL显色剂A，再加50 μL显色剂B，震荡混匀，37℃避光显色15 min;⑥加50 μL终止液，孵育15 min后，在酶标仪上于450 nm波长处测定各孔OD值;⑦以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，通过样品的OD值查出相应的浓度。

1.2.3 睾丸组织切片与染色观察

随机取各组大鼠左侧睾丸5只，去睾丸白膜，用Bouin's固定液固定后石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察生精小管形态和精子发生状态。

1.2.4 基因表达的半定量RT-PCR分析

用TRIzol试剂按说明书提供的方法提取总RNA。用SuperscriptTMIII逆转录酶合成cDNA第一链，用Tag DNA聚合酶进行PCR扩增反应。所检测基因是胶质细胞源神经营养因子(Glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)，引物序列为:gdnf(s):5’-GTCGCTAGCATGGGATTCGGGCC-3’;gdnf(a):5’-GAGAAGCTT TCAGATACATCCACACCGTTT-3’(218bp)。G3PDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内参照，G3PDH(s):ACCACAGTCCATGCCCATCAC，G3PDH(a):TCCACCACCCTGTTGCTGTA(450bp)。引物由上海生物工程服务公司合成。

1.2.5 统计分析

实验数据以平均数±S表示，数据用SPSS10.0软件进行统计处理，以One-way ANOVA评价组间差异。P＜0.05为差异显著。

2 实验结果

2.1 生精冲剂处理提高了大鼠血清FSH、LH和T水平

ELISA测定结果表明，药物组大鼠血清中FSH、LH和T水平与正常组相比略低，但无显著差异(P＞0.05)，与对照组相比明显升高，且差异显著(P＜0.05)(表 1)。

2.2 睾丸组织切片显示生精冲剂促进了精子发生过程

在光镜下观察各组大鼠的睾丸组织切片，发现正常组大鼠的曲细精管完整，较厚，生精细胞层数多，排列规则，各级生精上皮细胞层次明显，曲细精管管腔中有长形精子;药物组大鼠的曲细精管壁较溥，细胞排列不规则，有分化的精原细胞，管腔中没有长形精子;对照组大鼠的曲细精管不完整，生精细胞少，观察不到明显分化的精原细胞。

表1 血清FSH、LH、T的ELISA测定结果(n=5，)Table 1 Results of levels of FSH，LH and T in rat serum detected by ELISA(n=5，)

表1 血清FSH、LH、T的ELISA测定结果(n=5，)Table 1 Results of levels of FSH，LH and T in rat serum detected by ELISA(n=5，)

注:与对照组相比，*表示差异显著(P﹤0.05);#表示差异不显著(P﹥0.05)。Note:Compare with control，*represents the difference was remarkable(P ＜0.05);#represents the difference was not remarkable(P ＞0.05).

组别Group FSH level(pg/mL)LH level(pg/mL)T level(ng/mL)正常组 Normal Group 1682.76 ±13.37 1786.36 ±3.45 2.8.046 ±0.29 9 ±0.53药物组 Drug Group 1676.28 ±11.71*# 1772.15 ±6.46*# 2.73 ±0.31*#对照组 Control Group 1392.94 ±21.58 1296.25 ±12.49 2

图1 睾丸组织切片的HE染色图(×200)Fig.1 Tissue slice of the testis tissue by HE staining(×200)

图2 不同处理大鼠睾丸组织中的GDNF基因的表达Fig.2 The expressions of GNDF in different treatment rat testis analyzed by semi-qualitative RT-PCR

2.3 RT-PCR结果表明生精冲剂促进了GDNF表达

GDNF是促进精原干细胞自我更新、生精细胞增殖和睾丸支持细胞增殖的重要生长因子［9］。对正常组、药物组和对照组的大鼠睾丸组织中的GDNF基因表达的半定量RT-PCR分析结绳表明，药物组与正常组无明显差异，与对照组相比差异显著。在灌饲生精冲剂1个月后，睾丸支持细胞所分泌的GDNF水平与正常大鼠相近，而对照组的大鼠睾丸中的GDNF表达水平较弱(图2)。

3 结论与讨论

白消安(1，4-丁二醇二甲磺酸酯)主要用于治疗慢性粒细胞白血病，还能引起精原干细胞和各级生精细胞的大量凋亡，抑制精原干细胞的自我更新，对睾丸支持细胞促凋亡作用相对较弱，从而造成精子发生障碍，常用于制备生精障碍动物。一般情况下，这种生精障碍在处理后60～90 d时自然恢复［4，6］。生精冲剂的协定配方以补肾填精壮阳为主，对少精无精子症患者有一定疗效。本研究结果表明，生精冲剂能提高血清中FSH、LH和T水平，促进精子发生过程，这种促进作用的可能的机制之一是促进了GDNF的表达。

FSH主要作用于睾丸支持细胞，促进其增殖和分泌多种生长因子，这些生长因子是生精细胞增殖与分化所必需的。LH主要作用于睾丸间质细胞，促进其增殖和分泌睾酮等。睾酮是促进生精细胞分化的主要激素。在生精障碍模型大鼠睾丸中，由于绝大部分的精原干细胞和全部分化的生精细胞被去除，生精作用的恢复源于少量的精原干细胞。因此，睾丸支持细胞分泌的GDNF作用尤其重要。由于生精冲剂提高了FSH水平，促进了支持细胞的增殖和分泌活动，GDNF的表达量增加，从而促进了精原干细胞的增殖;LH水平的升高和T水平的升高是正相关的，也正是由天T的分泌增多，促进了精原干细胞的分化发育，导致精子发生过程的恢复加快。但是，睾丸支持细胞分泌的生长因子种类多，作用复杂，性激素水平的升高对其他生长因子的作用我们没有涉及，还有待于进一步的研究。

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