无机盐和蔗糖浓度对白色紫锥菊不定根生长及次生代谢产物积累影响

吴春华，王 淼，宋杭霖，崔锡花

1大连市农业科学研究院，大连 116036;2延边州农业科学研究院，龙井 133400;3韩国忠北大学尖端园艺研究中心，清州 361-763

药用植物不定根的培养可以直接快速获得植物的活性成分，较细胞培养遗传性稳定，较毛壮根培养更具安全性，是利用生物反应器大规模生产药用植物次生代谢产物的最佳培养材料［1］。无机盐和蔗糖是培养基中重要的营养成分，是利用不定根成功生产目标次生代谢产物的首要条件［2］。祝连彩等［3］利用紫松果菊无菌苗诱导了愈伤组织，且分析了总酚含量与多糖含量，Wu等［4］利用高产紫松果菊不定根在500 L气升式生物反应器中培养的菊苣酸含量是3年生栽培根的3.2倍，但国内外尚未有对白色紫锥菊不定根及其次生代谢产物紫锥菊苷培养的研究报道。

白色紫锥菊(Echinacea pallida)为菊科松果菊属多年生药用植物。原产北美，是国际公认的免疫增强剂，目前作为药物开发的同属品种还有紫松果菊Echinacea purpurea和狭叶紫锥菊Echinacea an-gustifolia［5］。白色紫锥菊主要含有紫锥菊苷、氯原酸和菊苣酸等咖啡酸衍生物，野生白色紫锥菊根系中紫锥菊苷含量为3～17 mg/g DW，菊苣酸为0.8 mg/g DW，紫锥菊苷是白色紫锥菊重要次生代谢产物，在紫松果菊中含量甚少［6］。紫锥菊苷具有抗肿瘤作用，对肝癌、肺癌、胃腺癌有明显抑制效果，还具有壮阳、抗衰老和治疗糖尿病等作用［5］。白色紫锥菊还含有抗氧化及清除活性自由基功能的酚类和黄酮类物质。

本研究在构建白色紫锥菊不定根液体培养体系的基础上，考察了无机盐浓度和蔗糖浓度对不定根生长及其次生代谢产物积累影响，为开发紫锥菊药品可提供富含紫锥菊苷等咖啡酸衍生物的高品质不定根系，也为其它药用植物活性成分的工业化生产奠定理论和实践基础。

1 材料和方法

1.1 不定根的培养

从加拿大引进的白色紫锥菊种子消毒后接种于MS培养基中，待种子萌发后将子叶接种在不定根诱导培养基MS+IBA1.0 mg/L。诱导的不定根液体悬浮培养在300 mL三角瓶中，装入100 mL的MS+IBA1 mg/L培养基，pH调至5.8，培养温度为25±1℃，暗培养，悬浮培养旋转速度为100 rpm，继代培养周期是30 d(图1)。

图1 白色紫锥菊不定根培养Fig.1 Culturing of E.pallida adventitious roots

1.2 无机盐浓度对不定根生长及咖啡酸衍生物合成的影响

不定根接种在IBA1mg/L，MS无机盐浓度分别调至 0.25 MS、0.5 MS、0.75 MS、1.0 MS 的培养基中，考察无机盐浓度对不定根生长及紫锥菊苷、菊苣酸、氯原酸、总酚类化合物和总黄酮类化合物等有效成分积累的影响。实验处理及次生代谢含量测定均是3次重复。培养条件与1.1相同。

1.3 蔗糖浓度对不定根生长及咖啡酸衍生物合成的影响

将不定根接种在0.75 MS+IBA1 mg/L，蔗糖浓度分别调至0%、1%、3%、5%、7%的培养基中悬浮培养，考查蔗糖浓度对不定根生长及有效成分含量的影响。培养条件与1.1相同。

1.4 不定根生物量的测定

将培养的不定根取出，用自来水冲洗干净后再用滤纸吸取表面水分，置于天平进行称重即为鲜重(FW)。将称过鲜重的不定根置于60℃烘干箱中烘干两天，使其干燥至恒重，称其干重(DW)，并计算其不定根干鲜重%比及生长率，生长率=(收获的不定根干重-接种量干重)/接种量干重。

1.5 生理活性物质的萃取［4］

称取磨碎的干燥不定根0.2 g，加入80%的甲醇10 mL，常温下用磁力搅拌器萃取15 min，离心10 min，提取上清液，残留物再一次同一方法萃取分离，最后定容至25 mL，用于测定生理活性物质含量。

1.6 总酚含量测定

福林法(Folin and Ciocalteu)测定:将0.1 mL萃取液中加入2.5 mL蒸馏水，再加入0.1 mL福林指示液，等待6 min加入0.5 mL的20%Na2CO3。反应液在常温下30 min暗反应，用紫外分光光度计760 nm波长下测定其浓度，标准液是Gallic acid。

1.7 总黄酮含量测定

儿茶素(Catechin)标准液法:0.25 mL萃取液加入1.25 mL蒸馏水，加入5%的 NaNO2溶液0.75 mL，6 min 后加入 10%的 AlCl3溶液 0.15 mL，待反应5 min后加入1M 的NaOH溶液0.5 mL，并用蒸馏水定容至2.5 mL，最后用紫外分光光度计510 nm下测定其浓度，标准液是Catechin。

1.8 咖啡酸衍生物含量的测定

HPLC分析:XTerra C18色谱柱(3 mm ×150 mm，3.0 μm);流动相 A(0.1%三氟醋酸水溶液)和B(乙腈);梯度洗脱:0～35 min，90%A;35～42 min，77%A;42 ～52 min，50%A;52 ～54 min，10%A;52 ～60 min，90%A;流速0.3 mL/min;检测波长330 nm。咖啡酸衍生物各标准品是从ChromaDex会社(Lagu-na Hills，CA，USA)购进，总咖啡酸衍生物含量是各咖啡酸衍生物含量之和。

1.9 统计分析

数据分析通过ANOVA和Duncans multiple range testes(DMRT)正反交实验，SAS8.1 software(SAS institute Inc.，Cary，NC，USA)进行，数据以表示。

2 结果与分析

2.1 无机盐浓度对不定根生长及咖啡酸衍生物积累影响

无机盐含有细胞组成的主要营养物质，因此对植物的生长及次生代谢产物的积累有很大影响。由表1是可知，无机盐浓度对白色紫锥菊不定根的生长以及酚类和黄酮类积累影响显著。白色紫锥菊不定根在0.25 MS和0.75 MS之间，随浓度增加生物量和生长率均增加，但高浓度1 MS培养基中生长量反而下降。当0.75 MS浓度时，不定根生长显著高于其它处理，此时鲜重为39.18 g/L，干重为3.93 g/L，生长率达4.61。不定根中总酚含量和总黄酮含量也在无机盐浓度0.75 MS时最高，总酚含量为27.92 mg/g DW，总黄酮含量达13.1 mg/g DW。

表1 无机盐浓度对不定根生长及酚类、黄酮类代谢产物积累影响Table 1 Effects of MS medium salt strength on adventitious root growth，phenolics and flavonoids content in E.pallida after 30 days of culture

不同无机盐浓度对不定根中咖啡酸衍生物积累影响见表2。由表2可知，低浓度0.25 MS和高浓度1.0 MS中咖啡酸衍生物含量均较少，0.5 MS和0.75 MS浓度中咖啡酸衍生物含量显著高于其它处理，其中0.75 MS浓度中总咖啡酸衍生物含量最高，氯原酸含量为3.91 mg/g DW，紫锥菊苷含量为7.36 mg/g DW，菊苣酸含量达4.08 mg/g DW，总咖啡酸衍生物含量达15.35 mg/gDW。对不定根生长以及总酚含量，总黄酮含量，咖啡酸衍生物积累综合考虑，对白色紫锥菊不定根的培养最适无机盐浓度是0.75 MS培养基。

表2 无机盐浓度对不定根培养中咖啡酸衍生物积累影响Table 2 Contents of caffeic acid derivatives in the adventitious roots of E.pallida as affected by MS medium salt strength after 30 days of culture

2.2 蔗糖浓度对不定根生长及咖啡酸衍生物合成的影响

蔗糖是组织培养中提供碳源的重要来源，培养基中蔗糖浓度可改变渗透压等很多因素。由表3可知，不同蔗糖浓度0%、1%、3%、5%、7%对白色紫锥菊不定根生长及酚类和黄酮类活性物质积累影响显著。不含碳源的0%浓度培养基中，不定根鲜重和干重均最低，生长率为负值，表明无碳培养基中不定根不能生长，酚类及黄酮量含量也是不足其它处理的1/2。蔗糖浓度在0～5%时，不定根生长及活性物质含量随蔗糖浓度增加而增加。当蔗糖浓度5%时，不定根生长量及总酚和总黄酮含量显著高于其它处理，此时不定根鲜重为41.39 g/L，干重达4.61 g/L，生长率为 5.59，总酚含量达 25.62 mg/g DW，总黄酮含量达13.39 mg/g DW。蔗糖浓度提高至7%时，不定根的干重、酚类及黄酮类含量反而比5%处理下降。

表3 蔗糖浓度对不定根生长及酚类、黄酮类代谢产物积累影响Table 3 Effects of sucrose concentration on adventitious root growth，phenolics and flavonoids content in E.pallida after 30 days of culture

不同蔗糖浓度对不定根中咖啡酸衍生物含量的影响见表4。由表4可知，蔗糖浓度在0～5%之间，咖啡酸衍生物含量随蔗糖浓度增加而提高，无糖培养基中咖啡酸衍生物含量最少，不定根生长最佳5%蔗糖浓度中氯原酸含量达3.79 mg/g DW，紫锥菊苷为7.40 mg/g DW，菊苣酸为3.96 mg/g DW，总咖啡酸衍生物含量达最高值15.15 mg/g DW，是无糖培养基的3～5倍。但蔗糖浓度5%和7%之间各生物指标无显著差异。以上不定根生长以及总酚含量，总黄酮含量，咖啡酸含量综合考虑可以看出，对白色紫锥菊的不定根培养最适蔗糖浓度是5%。

表4 蔗糖浓度对离体不定根培养中咖啡酸衍生物积累影响Table 4 Contents of caffeic acid derivatives in the adventitious roots of E.pallida as affected by sucrose concentration after 30 days of culture

3 讨论

MS培养基是植物组织培养中应用最为广泛的培养基之一，其无机盐浓度较高。无机盐浓度决定培养基的水分渗透压，高浓度无机盐引起培养基内很低的水分渗透压，植物不能从培养基中正常吸收营养成分和水分，反而低浓度无机盐含少量营养成分，不利于植物正常生长［7］。本文以通过改变MS无机盐的含量来考察无机盐浓度对白色紫锥菊不定根生长及其活性成分积累影响。白色紫锥菊不定根在低浓度0.25 MS和高浓度1.0 MS培养基中不定根生长及咖啡酸衍生物等含量均较少，对白色紫锥菊不定根最适无机盐浓度是0.75 MS培养基。不同植物对MS无机盐浓度的要求也不同，柴胡Bupleurum falcatum不定根在1.0 MS培养基中不定根生长及柴胡皂苷sailosaponin积累最好［8］，高丽参不定根生长最适无机盐浓度是0.5 MS，次生代谢物质人参皂甙积累最适浓度是1.0 MS［1］。贯叶连翘Hypericum perforatum不定根中金丝桃素hypericin积累最适无机盐浓度是0.5 MS，低浓度0.25 MS和高浓度2.0 MS均抑制不定根生长和金丝桃素的积累［9］，此结果与本实验结果基本相同。

蔗糖是组织培养中重要的碳源，初始蔗糖含量对植物组织或细胞的生长速率、次生代谢产物的合成影响甚大，低浓度的蔗糖往往难以满足培养物生长的需要，而高糖引起高渗透压也会对培养物的生长带来不利的影响，在植物组织培养中蔗糖初始浓度一般控制在3%～5%。白色紫锥菊不定根在蔗糖浓度0～5%之间，不定根生长及活性物质含量随蔗糖浓度增加而增加，不定根生长和咖啡酸衍生物等次生代谢产物积累最适蔗糖浓度是5%，当蔗糖浓度提高至7%时，不定根的干重、酚类及黄酮类含量比5%处理反而下降。不定根培养最适蔗糖浓度因培养材料不同而不同:高浓度蔗糖抑制不定根生长的结果在观叶连翘和狭叶紫锥菊中也报道过［9，10］。观叶连翘是3%蔗糖最适不定根生长，但5%和7%高浓度蔗糖适合次生代谢产物氯原酸和金丝桃素的合成［9］。高浓度蔗糖提高次生代谢产物含量是因为植物对渗透胁迫的应急反应［7］。

野生白色紫锥菊中紫锥菊苷含量为3～16 mg/g DW，菊苣酸为 0.8 mg/g DW［6］。本实验不定根中最高紫锥菊苷含量达7.4 mg/g DW，接近野生根系中含量;菊苣酸含量高达3.96 mg/g DW，是野生含量的4.8倍。此外，本实验还对酚类和黄酮类有效成分的积累也进行了考察，培养的白色紫锥菊不定根中总酚含量达25.62 mg/g DW，总黄酮含量为13.39 mg/g DW。这表明利用白色紫锥菊不定根在生产抗肿瘤作用的紫锥菊苷等咖啡酸衍生物和抗氧化及清除活性自由基功能的酚类和黄酮类物质等方面有很好的前景。本实验的研究为进一步大规模培养富含紫锥菊苷的高品质白色紫锥菊不定根系，开发紫锥菊药品和系列保健品奠定了理论和实践基础。

1 Paek KY，Chakrabarty D，Hahn EJ.Application of bioreactor system for large scale production of horticultulral and medicinal plants.Plant Cell Tiss Org Cul，2005，81:287-300.

2 Li Y(李琰)，Zhang CH(张朝红)，Ma XH(马希汗).Effects of medium concentration on callus growth and secondary metabolites of Eucommia ulmoides.J Wuhan Botan Res(武汉植物学研究)，2004，22:359-363.

3 Zhu LC(祝连彩)，Wang BC(王伯初)，Zheng C(郑超)，et al.Callus induction and its bioactive ingredient analysis of Echinacea purpurea.Acta Bot Boreal Occident Sin(西北植物学报)，2007，27:2451-2455.

4 Wu CH，Murthy HN，Hahn EJ，et al.Large-scale cultivation of adventitious roots of Echinacea purpurea in airlift bioreactors for the production of chichoric acid，chlorogenic acid and caftaric acid.Biotechnol Lett，2007，29:1179-1182.

5 Barrett B.Medicinal properties of Echinacea:a critical review.Phytomedicine，2003，10:66-86.

6 Pellati F，Benvenuti S，Magro L，et al.Analysis of phenolic compounds and radical scavenging activity of Echinacea SPP.J Pharm Biomed Anal，2004，35:289-301.

7 Paek KY.Plant tissue culture-technology.Korea-Seoul:Hyang moon sa，2003.

8 Yamamoto O，Kamura K.Production of saikosaponin in cultured roots of Bupleurm falcatum L..Plant Tiss Cult Biotechnol，1997，31:138-147.

9 Cui XH，Chakrabarty D，Hahn EJ，et al.Production of adventitious roots and secondary metabolites by Hypericum Perforatum L.In bioreactor.Bioresource Technol，2010，101:4708-4716.

10 Wu CH，Dewir YH，Hahn EJ，et al.Optimization of culturing conditions for the production of biomass and phenolics from adventitious roots of Echinacea aungustifolia.Plant Biol，2006，49:193.