栀早颗粒对性早熟大鼠血清生长激素、胰岛素样生长因子-I 水平的影响

杨丽珍,赵渺凡

(黑龙江中医药大学附属第一医院 儿科,黑龙江 哈尔滨 150040)

性早熟是一种生长发育异常,主要表现为第二性征提早出现。近年来随着我国人民生活水平的提高,随意给健康儿童进补的现象十分普遍,据不完全随意抽样调查统计,约0.67%儿童发育提前,有性早熟的趋势,约20%出现异常超重[1],其中以真性性早熟(亦称特发性中枢性性早熟ICPP)最为常见,约占女孩性早熟的80%～90%,男孩性早熟的40%[2-3]。该症主要由于下丘脑的神经内分泌功能失调致下丘脑—垂体—性腺轴(HPGA 轴)提前发动、功能亢进,导致第二性征提前出现、骨龄提前、骨骺过早闭合,儿童生长发育主要受生长激素-胰岛素样生长因子-I(GH-IGF-1)轴调控,而激素水平的提高导致性发育过早,也对患儿的心理发育产生不利影响。本实验通过对中药栀早颗粒对性早熟SD 大鼠干预机制的研究,观察对血清GH、IGF-I 水平的影响情况,为中医药治疗性早熟作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 SD 大鼠性早熟模型的建立

1.1.1 材料

1.1.1.1 喂养条件 1)选用SD 清洁级未孕大鼠,雌雄鼠20 对,体质量250～300 g(黑龙江中医药大学实验动物中心提供),饲养于开放系统实验室。2)温度范围19～29℃,湿度40%～80%,照明时间8:00-17:00,通风系统保持室内空气流畅。3)每星期早上定时换2 次垫料,早上定时换水和加饲料,水为一般的自来水,普通饲料,动物自饮自食。

1.1.1.2 药品试剂 达那唑胶囊(江苏联环药业股份有限公司,国药准字H20023116)每300 μg 溶解于25 μL 乙二醇/乙醇(V∶V=1∶1)混合液中。

1.1.1.3 仪器 Nikon 荧光显微镜、SN-659 型智能放免测量仪、AB204-E 电子分析天平、TGL-16G 台式离心机、TIZ5-WS 多管架自动平衡离心机、灌胃针、50 μL微量注射器等。

1.1.2 方法

1.1.2.1 种鼠选择 配种选用SD 清洁级未孕大鼠,雌雄鼠20 对,体质量250～300 g,一对一笼喂养交配,全价营养配方饲料,自饮自食。每天早上定时查看阴栓,有阴栓的选用母鼠饲养于另一只塑料笼盒中,并在笼上贴上标签,标签上写明配种日期、阴栓日期和笼号,笼号顺序从1～n 开始编号。

1.1.2.2 动物分组 出现阴栓后第19 天以后每天上、下午定时查看仔鼠出生情况,若有出生则选用雌仔鼠,称体质量,记录雌鼠数量,在笼表签上再填上出生日期。选用4 d 内出生的雌鼠。点数,分笼,分组,分为正常对照组(Normal-Control,NC组)、IPCC 模型组(model,M组)、GnRH-A 对照组(GnRH-A,GA组)、栀早颗粒高剂量组(ZZKL-H组)、栀早颗粒中剂量组(ZZKL-M组)、栀早颗粒低剂量组(ZZKL-L组)。每组鼠数控制在8 只以上,每笼出生鼠由亲母自养,每笼8 只,若每笼出生雌鼠数量不足8 只,则用该亲母生的雄仔鼠凑足8 只,确保每笼内饲养密度一致,体质量一致,以达到饲养条件一致。从出生开始每隔3 d记1 次体质量,每天早上定时记录,并写在体质量记录表上。

1.1.2.3 造模 用酒精棉签消毒,用50 μL 微量注射器吸取25 μL 达那唑溶解液皮下注射。注射时防止液体溢出,若有溢出则丢弃。模型组、GnRH-A组、栀早颗粒高剂量组、栀早颗粒中剂量组、栀早颗粒低剂量组于出生最早的雌性大鼠为5日龄同1 d 每只皮下注射25 μL 达那唑溶液,正常对照组不予处理。

1.2 SD 大鼠实验方案

1.2.1 实验药物

1.2.1.1 抑那通 注射用醋酸亮丙瑞林(促性腺激素释放激素类似物制剂)。GnRH-A组以抑那通为对照药物。抑那通针剂首剂、次剂用量均为2.5 倍临床等效剂量,分别为1 573.5 μg/kg 和1 180 μg/kg,配制时用原配的溶液溶解,再加灭菌注射用水稀释而成,浓度分别为157 μg/mL 和118μg/ mL。

1.2.1.2 栀早颗粒中 夏枯草、栀子、柴胡、白芍、荔枝核、牡蛎、瓜蒌、浙贝母、郁金(由江苏江阴天江制药有限公司制备),1 剂9 g,用温开水溶解。栀早颗粒高、中、低剂量组分别按生药量5.40 g/(kg·d),2.70 g/(kg·d),1.35 g/(kg·d),分别相当于临床人用量的14 倍、7 倍、3.5 倍灌胃。

1.2.2 实验给药方法与剂量 栀早颗粒中药组大鼠在15日龄时开始用灌胃法喂栀早颗粒,每只每次喂饲3 mL,每天1 次,模型组给予等量的生理盐水灌胃。GnRH-A组大鼠在15日龄时以抑那通于右后肢处肌注,隔日1 次,首次给药剂量为1 573.5 μg/kg,次剂用量1 180 μg/kg。大鼠25日龄时开始每天检查阴门开口情况,如动物在第1 次检查时阴门已经开口,则阴门开口时间记为25 d。从大鼠阴门开口日起,每天上午定时做阴道涂片,直至大鼠建立正常的性周期。

1.2.3 标本采集及检测指标 用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg,腹膜内注射)麻醉,麻醉后,摘眼球取血3 mL,室温凝血后,3 000 r/min,离心20 min,取血清,-20℃冻存,以备检查血GH、IGF-I 水平。

1.2.4 采用酶联免疫法检测 IGF-1 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)。已知IGF-1 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将IGF-1 和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色,颜色的深浅和样品中IGF-1 的浓度呈比例关系。GH 试剂盒同理。试剂盒购自美国RD 公司,严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计分析软件处理资料,计量资料用均数±标准差()表示,采用t 检验进行分析。判断均数差异显著性,当P ＜0.05时,差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠血清GH 、IGF-I 水平比较,见表1。

表1 各组大鼠血清GH、IGF-I 水平比较()

表1 各组大鼠血清GH、IGF-I 水平比较()

注:与性早熟模型组比较,#P ＜0.05。

3 讨论

正常青春发育的发动缘于下丘脑脉冲分泌释放促性腺激素释放激素(GnRH)而激活垂体—性腺轴的青春发育过程。而GH-IGF-1 轴是一个对人体内分泌代谢很重要的部分,尤其是调控青春期的生长发育,且GH 的促生长作用是通过肝肾等组织依赖IGF-I 来介导的,IGF-I 直接作用于靶细胞又对GH 的分泌有着反馈抑制作用。近年来的很多研究[4-9]表明,生长激素(GH)、瘦素(Leptin)、甲状腺素等很多激素均可对性腺轴产生影响,且发现IGF-I 是联系营养和生殖的纽带,是青春发动的重要信号之一。性腺轴和促生长轴在青春期生长中有不可分割的有机联系。青春期的身高突增有赖于两者的协调调控。如果能明确GH-IGF-I 轴的作用机制将对于指导我们在临床上相关的疾病诊疗用药方面有很高的现实意义。

根据[10]哈尔滨地区性早熟女童发病因素的调查及与中医辨证分型的关系,发现哈尔滨市性早熟女童以肝郁化火痰结型为主,治疗应以疏肝、清肝、化痰软坚法为主,同时依据祖国医学中医女子以肝为先天的理论,结合多年临床经验,应用纯中药制剂栀早颗粒于临床治疗性早熟多年,效果显著。本实验也为进一步阐明应用栀早颗粒不同剂量来干预性早熟模型大鼠血清GH、IGF-I 的水平机理,从而证实了栀早颗粒高、中组剂量能有效抑制血清GH、IGF-I 的浓度。因此我们可以认为降低GH、IGF-I 的血清水平是栀早颗粒可以有效的减缓第二性征的提前出现,减慢骨龄增长骨骺愈合速度的作用机制之一。或许在其他方面也可以进一步探讨栀早颗粒能够抑制青春期过早启动,比如明确大鼠下丘脑Leptin 受体,肝脏IGF-ImRNA 表达情况等方面,这些都与性早熟密切相关,值得我们日后更加深入的研究,用更多现代科研手段寻找治疗性早熟作用的靶点[11-12]。

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