火炮打击兔应激防护模型脑组织病理及NMDA-R1表达的形态学研究

周龙 张建华 林进皇 俞雄杰 郁毅刚

火炮打击兔应激防护模型脑组织病理及NMDA-R1表达的形态学研究

周龙 张建华 林进皇 俞雄杰 郁毅刚

目的 探讨实弹演习火炮打击后, 不同位置掩体保护下兔脑组织病理及NMDA-R1表达的变化。方法 闽南山地团进攻演习, 30只实验兔随机分为空白对照组, 反角隐蔽组和迎面隐蔽组。火炮打击应激损伤后6 h, 各组存活兔取脑组织, 观察其病理损伤形态学及NMDA-R1表达的变化。结果 与空白对照组比较, 反角隐蔽组和迎面隐蔽组NMDA-R1表达强阳性, 脑组织结构层次被破坏, 神经细胞变性坏死, 间质出血；迎面隐蔽组NMDA-R1免疫反应强度亦高于反角隐蔽组。结论 火炮打击后兔脑组织应激损伤反应强烈, 反角掩体保护能够减轻脑组织损伤, NMDA-R1参与脑组织损伤病理过程。

火炮打击；兔；应激防护模型；脑组织；NMDA-R1

正常情况下机体的应激反应是有利的, 有助于机体快速适应内外环境因素的变化, 但过大过长的应激反应会对机体产生有害的影响, 产生病理性应激［1］。病理性应激是机体对严重应激因素(如创伤、打击、爆炸等)的一种异常反应,其生理过程主要表现为下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamopituitary-adrenal, HPA)轴神经内分泌调节功能紊乱, 导致持续过度的糖皮质激素升高［2］。近年来, 人们发现N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAr)的变化与创伤后神经-内分泌-免疫功能紊乱的发生机制有关［3］。本课题通过建立火炮打击兔应激防护模型, 进行应激状态下兔脑组织病理变化及NMDA-R1表达的形态学研究, 现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、动物及试剂 团进攻炮火覆盖火力类型：武装直升机火箭弹、XX自行榴弹炮、XX牵引加农炮、XX自行火箭炮、水陆两栖坦克、XX轮式突击炮、XX迫击炮、XX反坦克导弹。健康成年日本大耳白兔30只, 雌雄不拘,清洁级, 体质量2.5～3.0 kg(厦门大学医学院动物中心提供),随机表法分为3组, 空白对照组6只, 反角隐蔽组6只, 迎面隐蔽组18只(距离攻击目标10 m隐蔽组6只, 20 m隐蔽组6只, 3 0 m组隐蔽6只)。

1.2 实验方法 按照文献［4］方法设计实验, 实验时间和环境条件为南方秋季中午山地环境, 环境温度16℃～28℃, 湿度43%～65%。实验兔常规喂养, 演习当日凌晨运至目标高地,炮靶前迎面10 m、20 m、30 m处挖掘约1 m深掩体, 各放置实验兔6只, 上覆盖硬质木板、松枝, 留通气道。炮靶后反角10 m处挖掘同样掩体, 放置实验兔6只。空白对照组于炮靶阵地外10 km营区喂养。中午演习开始, 全过程2 h。轰炸机俯冲(未投弹), 持续火炮急袭5 min。各型火炮、坦克、导弹、武装直升机集群连续发弹若干, 期间暂停两次, 各10 min。演习结束, 工兵排爆清理阵地后进场取回实验兔。伤后6 h处死存活兔解剖, 取脑组织标本, 4%甲醛固定。

1.3 脑组织病理检测 取4%甲醛固定脑组织, 石蜡包埋,切片行HE染色, 光镜下观察形态学变化, 由同一病理医生采用盲法评价。观察脑组织结构层次是否完整, 神经细胞肿胀、变性、坏死, 间质出血、水肿等情况。

1.4 脑组织NMDA-R1免疫组化表达的测定 取4%甲醛固定脑组织, 石蜡包埋, 连续切片(4 μm), 每例标本切5张免疫组化染色用。采用改进型SP法进行免疫组化染色, 严格参照试剂盒说明操作。试剂盒型号, 购于XX公司。每次染色时均用已知阳性切片作阳性对照, 用PBS(磷酸缓冲液, 0.01 mol/L, pH值7.2)代替一抗作阴性对照。NMDA-R1表达均位于胞质和胞核内, 表现为浅黄、棕黄或棕褐色。用半定量法评估其染色, 无阳性细胞数为(-), 阳性细胞数25%以下为(+), 25%～50%为(++), 51%～75%为(+++), 超过75%为(++++)。

2 结果

2.1 兔一般情况 各组实验兔均无直接火力命中。与空白对照组比较, 反角隐蔽组实验兔全部存活, 部分精神萎靡,反应迟钝, 伏地, 少部分耳道出血。因弹着点不规律, 迎面隐蔽3组距离无差异, 合并为1组。迎面隐蔽组18只实验兔当场死亡9只, 至伤后6 h取脑组织标本前再死亡3只,死亡率达66.7%(12/18)。剩余6只存活实验兔编为迎面隐蔽组, 与另外两组同时刻点取脑组织进行病理形态学及组化检测, 每只取五张切片进行组化表达强度及形态学观察研究。

2.2 脑组织HE染色结果 空白对照组脑组织切片HE显示, 分子层, 内、外颗粒层及锥体细胞层结构完整, 均匀致密；锥体细胞数量丰富, 胞体致密, 核居中, 轴突完整、干净,向四周延伸；间质为少量血管及白质, 肌浆深染, 胶质丰富,可见散在分布血管, 腔内可见少量红细胞, 未见炎症细胞(图1、图2)。反角隐蔽组脑组织切片HE显示, 分层结构存在,锥体细胞数量减少, 胞体稍肿胀, 可见空泡变性, 轴突断裂；细胞间少量红细胞分布, 间质少量炎细胞浸润(图3、图4)。迎面隐蔽组脑组织切片HE染色显示, 细胞结构层紊乱, 分界不清, 部分坏死, 崩解；细胞数明显减少, 胞体肿胀, 体积增大, 轴突消失, 白质稀疏；间质充血, 可见散在红细胞分布及浆细胞浸润(图5、图6)。

2.3 脑组织NMDA-R1免疫组化的表达 各组神经元锥体细胞中均有NMDA-R1表达, 主要在神经元膜表面表达, 免疫反应强度有差异。空白对照组可见神经元形态完整、胞膜淡染, NMDA-R1蛋白少量表达(+)(图7、图8)。反角隐蔽组可见神经元胞体肿胀, 细胞数量减少, 细胞膜典型黄染, NMDA-R1中量表达(++)(图9、图10)。迎面隐蔽组, 可见大量神经元坏死崩解, 残存神经元形态数量稀少, 胞体肿胀, 体积巨大, 胞核溶解, 大部分胞质、胞膜均黄染, 色深, NMDA-R1大量表达(++++)(图11、图12)。迎面隐蔽组、反角隐蔽组NMDA-R1免疫反应强度均高于对照组, 同时迎面隐蔽组NMDA-R1免疫反应强度亦高于反角隐蔽组。

图1 空白组HE染色(×100)

图2 空白组HE染色(×400 )

图3 反角组HE染色(×100)

图4 反角组HE染色(×400)

图5 迎面组HE染色(×100)

图6 迎面组HE染色(×400 )

图7 空白组Nr1组化(×100)

图8 空白组Nr1组化(×400)

图9 反角组Nr1组化(×100)

图10 反角组Nr1组化(×400)

图11 迎面组Nr1组化(×100)

图12 迎面组Nr1组化(×400)

3 讨论

爆炸及爆炸应激性脑损伤是战争中人员遭受的一种多发而又严重的颅脑损伤, 在美军近年的军事行动中, 爆炸冲击波性脑损伤的发生率约为40%～60%, 约有32万服役人员或战士遭受过爆炸冲击波脑损伤［5］, 即使爆炸外围没有直接受到冲击波影响的战士, 也因爆炸应激性损伤而导致脑组织及细胞发生相应的生理病理变化［6］。有报道显示［2］, HPA轴系统在应激反应调控中的作用与NMDA-R活化有着密切的联系。因此, 为了了解爆炸及爆炸应激状态下脑组织损伤的病理生理机制, 作者建立火炮打击兔应激防护模型, 进行应激状态下兔脑组织病理变化及NMDA-R1表达的形态学研究。结果提示：与空白对照组比较, 反角隐蔽组和迎面隐蔽组脑组织病理切片及免疫组化均可见脑细胞结构层紊乱, 部分神经元变性、坏死、崩解, 细胞数减少, 胞体肿胀, 体积增大, 胞核溶解, 细胞间质充血, 浆细胞浸润等脑组织损伤的病理表现, 并且迎面隐蔽组上述表现更明显和严重。同时, 迎面隐蔽组脑组织NMDA-R1大量表达(++++), 反角隐蔽组脑组织NMDA-R1中量表达(++), 而空白对照组脑组织NMDA-R1少量表达(+), 与脑组织病理损伤结果具有一致性。以上结果表明, NMDA-R1参与了爆炸及爆炸应激状态下脑组织病理损伤过程。

NMDA-R是一种兴奋性氨基酸的特异性离子型受体, 它与学习、记忆及神经系统生长发育的可塑性都有密切关系,主要分布于大脑皮层、丘脑、纹状体、海马等的突出后膜上, NMDA-R通道对Ca2+具有高度通透性, 在正常生理条件下, 由于离子通道内部Mg2+的阻滞作用, 通道并不开放［7,8］。NMDA-R参与兴奋性突触传递、神经递质释放等生理活动,其参与脑组织病理损伤的机制为：①NMDA-R1激活HPA轴促进肾上腺皮质激素的分泌和释放。Son等［9］通过实验证实应激状态下脑海马内NMDA-R1水平存在明确的改变。严重创伤应激后海马NMDA-R激活, 下调海马糖皮质激素受体进而影响糖皮质激素在海马水平的负反馈调节, 导致HPA轴亢进, 内源性糖皮质激素过度增多［10,11］。现已证实, 过度升高的内源性糖皮质激素是病理性应激损伤的主要因素之一, 影响神经系统的突触可塑性［12］。②介导兴奋性氨基酸的神经毒性作用。谷氨酸是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质, NMDA-R是其特异性离子型受体, 脑损伤时脑细胞外谷氨酸浓度大量增加, NMDA-R1迅速被激活, 并诱导神经元兴奋毒性、激发神经元的退化及神经细胞死亡等过程。岳少杰等［13］研究表明谷氨酸可致胶质细胞的肿胀、坏死及海马区神经细胞凋亡；Ros等［14］也报道谷氨酸可导致大脑皮层损害。③参与继发性脑组织水肿及创伤应激产物的形成。有报道证实［15］：NMDA-R1过度激活可介导Na+主动内流,随即Cl-、水被动内流, 神经细胞急性渗透性肿胀；同时, 其过度兴奋介导的神经元迟发性损伤, 以Ca2+内流为特征并激活膜磷脂酶活性, 引起白细胞三烯、前列腺素和花生四烯酸等产生增多, 导致脂质过氧化和自由基形成, 激活各种蛋白酶导致细胞骨架降解, 细胞裂解。④介导炎症反应性损伤, NMDA-R数量的增加可导致细胞对炎症的敏感化, 加重继发性炎症反应性脑损伤, 而NMDA-R在神经细胞膜上的表达量是调节神经细胞炎症应激强度的关键［16］。

综上所述, 通过观察实弹演习对火炮打击兔应激防护模型的实验研究, 作者探讨战场环境下火炮打击应激复合损伤-保护因素对脑组织病理损伤的特点, 为战争环境下颅脑爆炸冲击及爆炸应激伤的诊治提供了新的思路。

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Morphological study on NMDA-R1 expression and pathology research on injury brain tissue of artillery attacking stress protective rabbits model

ZHOU Long, ZHANG Jian-hua, LIN Jin-huang, et al.Department of Trauma Neurosurgery, 175th Hospital of PLA Dongnan Hospital Affiliated to Xiamen University, Zhangzhou 363000, China

Objective To study the NMDA-R1 expression and pathology on injury brain tissue in rabbits hidden in different positions of blindage after real artillery attacking in battlefield.Methods 30 Japanese white rabbits were randomly divided into 3 groups, blank group, reverse hidden group and frontage hidden group in mountain regiment artillery attacking maneuver at southern of Fujian.The NMDA-R1 expression and pathology on injury brain tissue in rabbits were observed and recorded in 6 hours after injury.Results Compared with the blank group, the NMDA-R1 expression in reverse hidden group and frontage hidden group were strong positive, brain tissue structure were destroyed, nerve cells degeneration necrosis and brain tissue i nterstitial hemorrhage.Tthe NMDA-R1 expression in frontage hidden group were stronger than reverse hidden group.Conclusion The stress injury response is very strong in rabbits attacked by artillery, reverse blindage protection can reduce degree of brain tissue injury, NMDA-R1 participates in brain tissue injury pathological process.

Artillery attack; Rabbit; Stress protective model; Brain tissue; NMDA-R1

全军十一五医学科研基金面上项目(项目编号：06MB152)；福建省漳州市科技计划项目(项目编号：Z10071)；南京军区医学科技计划项目(项目编号：12MA065)

363000 漳州,解放军第一七五医院暨厦门大学附属东南医院神经外科(周龙 林进皇 郁毅刚)；解放军73131部队(张建华 俞雄杰)

郁毅刚 E-mail：yu-yg@tom.com