APNP对白念珠菌杀菌效果研究

连昕 陈娟 冯爱平 曾敬思 郑岳臣

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科，武汉 430022;2.华中科技大学同济医学院附属协和医院超声影像科，武汉 430022)

等离子体(Plasma)是气体在加热或强电磁场作用下电离产生的气体云［1］。常压等离子体是在非真空条件下获得的，按照带电粒子温度的相对高低分为高温和低温等离子体，常压低温等离子体又称为APNP(Atmospheric pressure non-equilibrium plasma，APNP)。它以射频电容耦合的方式在大气压下产生，其温度低，等离子体面积较大而均匀，产生的等离子体活性高，且对活体组织无损伤［2-3］。国内外大量最新研究表明，等离子体有很强的杀灭微生物的作用，但对于其杀真菌效果、参数选择和机制则研究较少。本文旨在通过观察不同放电气体、作用时间和作用距离的APNP对白念珠菌的杀灭效果及作用后菌体的超微结构变化，初步了解其对真菌的杀灭作用、参数选择及作用机制，为其应用于临床消毒杀菌提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌液制备

白念珠菌标准株C1a，由华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科真菌室提供。冻干菌种融化后，复苏划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿，至少传代2次。取典型单菌落，以无菌生理盐水稀释，电动混合器振荡20 s，使真菌孢子悬浮均匀，血细胞计数板计数，4℃保存备用。

1.2 APNP 喷流装置

此装置基于DBD(电介质阻挡放电)，当在进气口通入He/O2的混合气体时，在喷嘴末端将产生羽毛状的APNP喷流。实验中采用脉冲直流电源，放电电压8 000 V，输出频率10 kHz，脉宽1 600 ns。

1.3 APNP喷流处理后白念珠菌生长情况观察

取制备好的菌液，调整菌悬液浓度为1×105～1×106/mL。取无菌载玻片，吸取10 μL菌悬液均匀涂布并晾干。标本分为1、2、3组，1组用于比较不同气体流量的杀菌效果，2组用于比较不同作用距离的杀菌效果，3组用于比较不同作用时间处理后的杀菌效果。以上各组参数设置如表1所示，每不同参数小组均为5个载玻片标本。处理后的5个载玻片标本中，2个用于扫描电镜和透射电镜观察，另外3个经清洗后稀释，并接种于沙氏培养基平皿，置于37℃恒温培养箱中培养，每天观察菌落生长情况，并于培养72 h后采用平板计数法获得处理后各标本的菌落形成单位(Colony Forming U-nit，CFU)，计算3个标本的平均值作为最终CFU。1.4 APNP喷流处理后白念珠菌超微结构观察

实验组及对照组标本分别经日立S-570型扫描电镜及FEI TEcnai G212型透射电镜观察并拍照。

表1 各实验组等离子体作用参数Tab.1 Action parameters of APNP flow for each experimental group

2 结 果

2.1 不同参数APNP喷流处理后白念珠菌生长情况

每24 h观察菌落生长情况，共观察72 h。等离子体处理24 h后，所有平皿中只有对照组长出细沙状菌落;48 h后处理组可见稀疏菌落生长;72 h后平皿均出现奶酪样乳白色菌落，处理组与对照组相比菌落明显稀疏(见图1)。

图1 经APNP处理的白念株菌标本72 h后的生长情况:a.1-A组(对照组)，b.1-B 组，c.2-B 组Fig.1 Growth situation of Candida albicans strains，72 hours after managed with APNP

不同气体流量的比较(1组):72 h后对照组菌落分布均匀，大小一致，处理组的平皿菌落稀疏，与对照组相比，菌落生长明显被抑制。且随着放电气体中氧气含量增加，抑制效果更加明显。对菌落生长的抑制作用强弱依次为:He/O2流量2/0.06 L/min＞2/0.04 L/min＞2/0.02 L/min(见图2a)。

不同作用距离的比较 (2组):在相同的气体流量和作用时间下，随着等离子体喷嘴与标本间距离的减小，其作用后菌株生长抑制更加明显(见图2b)。

不同作用时间的比较 (3组):选择气体流量参数 He/O2为2/0.06 L/min，作用距离为1 cm，作用时间分别为2 min、3.5 min、5 min 和 10 min。与对照组相比，处理组菌落稀疏，处理时间越长抑制作用越明显。处理3.5 min后的标本菌落生长即明显被抑制，随着时间的延长，菌落逐渐稀疏，作用10 min后标本几乎无菌生长。不加电压，仅喷射He/O2气体的标本菌落生长情况与对照组无区别(见图2c)。

图2 APNP作用后72 h不同气体流量 (a)、作用距离 (b)、作用时间(c)组白念珠菌CFUFig.2 CFU of Candida albicans strains，72 hours after managed with APNP of different gas flow(a)，operation distance(b)and action time(c)respectively

2.2 经APNP处理后白念珠菌超微结构改变

以3 组 (3-A、3-D、3-E、3-F 组)为例，扫描电镜下对照组(3-A组)白念珠菌孢子形态饱满，细胞壁完整，轮廓清楚，大小形态正常，APNP作用后菌体结构有明显改变，等离子体作用3.5 min(3-D组)后菌体体积增大，细胞表面皱缩不平，细胞壁分层，细胞壁外膜有严重皱折、剥脱及裂痕;作用5 min(3-E组)的菌体损伤更加明显，细胞壁裂痕明显，且部分细胞干瘪，提示细胞壁已破裂，细胞质外漏;作用10 min(3-F组)的菌体胞壁呈碎片状并伴有细胞质的流出，菌体间出现融合现象，菌体间隔模糊，细胞形态难以辨认(见图3)。

透射电镜下(见图4)正常白念珠菌菌体形态完好，呈圆形或椭圆形，细胞壁质地致密，呈低电子密度的灰白色、厚薄均匀、规则，细胞膜完整，胞质均匀(A);处理后细胞形态明显改变，细胞壁不完整、变薄，局部有缺损，部分在出芽部位缺损 (B)，质地疏松，部分变成高电子密度的黑灰色 (B);细胞膜不完整。局部有缺损 (B);胞质不均匀，电子密度低，胞内物质少，疏松 (B、D、E)，部分有空泡状物及光亮区形成;核膜被破坏，核内物质散乱(F)，有核固缩现象 (C)。

3 讨 论

真菌是广泛分布于自然界的微生物，引起人类发病的大多为条件致病菌。随着免疫缺陷、抑制人群的逐渐增多，深部及系统性真菌感染的发病率和死亡率不断上升，其感染早期诊断困难、治疗棘手、预后不良，已经成为血液病、器官移植、艾滋病及ICU患者的主要死因［4］。临床上导致深部感染的最常见病原真菌为白念珠菌［5］，其广泛存在于与人类密切接触的室内外环境中以及日常生活、医疗用品上，因此免疫缺陷患者所处的环境及所使用的医疗、生活用品均要求进行严格的抗真菌处理。

随着利用生物、光学、橡塑、光纤和晶体等材料的先进医疗器械及医用材料不断出现，对这些材料，既不能用高温高压消毒处理，也不能简单地使用放射源、紫外或其他化学方法灭菌。理想的可用于临床的低温灭菌技术应该具有以下一些特性［6］:①灭菌时间短，少于传统的热力灭菌法。②灭菌温度低于50℃。③能够满足多种物体的灭菌需要。④灭菌过程对于操作人员、患者和被灭菌物体都应是无害的。低温等离子体灭菌法能满足以上要求，并且在对物体进行有效灭的情况下，对物体的损害最小［7］。

本实验证实，APNP对于临床常见致病真菌白念珠菌具有明显的杀灭作用，且电镜观察发现处理后的白念珠菌细胞壁、细胞膜破裂，胞内物质外流，细胞内物质少、疏松，核膜被破坏、核内物质散乱。因此细胞壁破裂，进而导致胞内物质的损害可能是导致菌体死亡的原因。

等离子体主要由带电粒子、紫外线及多种活性自由基组成，这些成分对微生物具有很强的杀灭作用。关于等离子体杀灭微生物的机理，Mendis［8］研究组指出带电粒子可能在细胞外膜表面积累，产生超过细胞膜自身张力的静电力，从而引起细胞破裂。而在本实验中，等离子体喷流装置使受试菌体远离放电腔，当气体离开发生腔之后带电粒子很快消失，因此带电粒子使白念珠菌细胞壁及细胞膜破裂的可能性很小。另外，本实验所采用的等离子体喷流装置产生的紫外线可以忽略不计，因此我们推测活性氧自由基是APNP杀菌作用的主要机制。Montie等［9］认为是活性自由基导致了细胞外膜的破裂。Sharma等［10］则认为等离子体中的活性氧自由基与细胞壁上的碳反应，生成二氧化碳并挥发掉，从而破坏细胞壁，直接影响到核酸。Q.S.Yu等［11］利用常压等离子体刷处理大肠杆菌，发现He-O2混合气等离子体失活微生物的效率比单纯氦气的更高，因此他们认为氧活性成份在等离子体失活微生物过程中起重要作用。Lee等［12］亦通过等离子体杀灭真菌-酿酒酵母的实验证实其杀菌作用主要来自于活性氧自由基。本实验还进行了不加电压，只有气吹的对照实验，发现该对照组与未经任何处理的对照组无差别，说明气吹在杀菌过程中不起作用。本实验中采用的放电气体是He和少量的O2，在放电过程中，形成氦亚稳粒子的几率非常高，这些亚稳粒子可以通过碰撞把能量转移给通入的O2以及喷口处空气中的O2或N2等气体，通过一系列反应会产生 O* (活性氧原子)、O、O3、NO、NO2、OH等活性粒子。这些活性粒子可以同菌体细胞壁中某些物质反应生成二氧化碳和水等挥发性物质，同时与细胞膜脂蛋白或细胞膜中的磷脂类、蛋白质等发生化学反应，从而使细胞壁、细胞膜受到破坏，造成局部缺损或通透性改变，进而使细胞内物质改变，此外这些活性粒子还会迅速扩散进入细胞内，氧化细胞内酶或RNA、DNA，导致菌体死亡。

图3 等离子体处理后白念珠菌菌体结构改变 (×10 000):a.3-A组，b.3-D组，c.3-E组，d.3-F组 图4 正常对照标本 (a)与等离子体处理 5 min 后标本(b，c，d，e，f)透射电镜观察Fig.3 Structural modification of the Candida albicans strains after treated with APNP Fig.4 Normal control strain(a)compared with strains treated with APNP for 5 min(b，c，d，e，f)under transmission electron microscope

本实验中，等离子体对白念珠菌的杀灭作用与放电气体中氧气含量、处理时间、作用距离明显相关。通入的放电气体成分不同，等离子体中各种活性粒子的成分和比例就不同，灭菌效果相应受到影响。本实验中，随着O2含量的增加，杀菌效果亦更加明显，说明了氧活性成份在等离子体杀灭微生物过程中起主要作用。另外，等离子体与标本距离越小、作用时间越长杀菌效果越好，可见，与其他灭菌方法一样，灭菌时间与作用距离也是影响杀菌效果的重要因素。

本实验研究了APNP喷流对白念珠菌的杀菌效果，发现它能有效地杀灭白念珠菌，且其杀菌机制与活性氧成分破坏真菌细胞壁、细胞膜及细胞内结构有关，但此发现还需要进一步试验予以证实。另外，APNP是否还存在除活性氧以外的杀菌机制，其对除白念珠菌以外的临床常见致病真菌的杀菌效果如何，其用于临床疾病治疗的可行性等，还有待进一步研究。低温等离子体杀灭真菌的研究及应用对于建立安全、简便、低温且无残留毒性的灭菌及治疗方法具有重大意义，必将推动灭菌技术及真菌感染性疾病临床治疗的发展。

致谢:感谢华中科技大学电气与电子工程学院低温等离子体实验室卢新培教授、熊紫兰博士提供等离子体设备并给予技术支持。

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