新生隐球菌生物膜动物感染模型的构建及其活性的检测

周洁 潘炜华 廖万清

(上海长征医院皮肤病与真菌病研究所全军真菌病重点实验室第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003)

生物膜现象最早在细菌中发现，现已证实许多致病真菌也可形成生物膜［1］。不同于细胞质膜系统的概念，生物膜 (biofilm)是相对游离态而言的一种微生物存在形态，是大部分微生物在自然环境的主要存在形式，对于微生物而言是一种保护机制，能保护其免受抗生素的损害作用并能引起持续感染，故在临床感染中有着重要意义［2］。临床上大约有65%的感染与微生物在组织、器官或医疗设备表面形成生物薄膜有关［3-4］。由于体外模型的限制，对于新生隐球菌生物膜的研究一直停滞不前。我们利用SD大鼠体内置管的方法构建了新生隐球菌生物膜感染模型，便于开展对于新生隐球菌在宿主体内代谢水平、耐药等一系列生物学活性的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 新生隐球菌标准菌株H99(血清型A型):由中国医学菌种保藏管理中心隐球菌专业实验室提供。

培养基 酵母浸膏(YEPD)液体和SDA固体培养基，DMEM液体培养基(杭州四季青，中国)。

药物 注射用环磷酰胺(Sigma 218707，美国)。主要试剂与器材 1%戊二醛磷酸盐缓冲液，由上海复旦大学电镜室提供;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，MTT(Sigma M5655，美国);二甲亚砜，DMSO(Amersco 0464，美国);小牛血清 (杭州四季青，中国);24孔细胞培养板(Corning，美国);普通光学显微镜、倒置显微镜(OLYMPUS公司，日本)，扫描电子显微镜 (日立TM-1000，日本)，酶标仪 (Beckman AD340，美国)。

实验动物 体重约200 g的雌性SD大鼠10只(复旦大学实验动物中心)，鼠龄3～4周，随机分为实验组和对照组，每组各5只。其中，实验组大鼠按照50 mg/kg腹腔注射环磷酰胺进行免疫抑制，对照组仅给予腹腔注射相同容量的生理盐水。

1.2 方法

菌悬液的制备 菌株于沙氏培养基中-70℃保存，在实验前1 d转种于YEPD液体培养基中，37℃，150 r/min摇床培养1 d，再转种于SDA固体培养基，35℃恒温培养2 d。取单菌落5个稀释于DEME液体培养液，经血细胞计数板计数，调整菌液浓度至1×105/mL。

植入物的准备 ①导管准备:输液器针头套管，内径2.2 mm，剪成长度为1 cm的片段。分别经碘伏、75%酒精浸泡24 h，经培养证实无菌。②内置薄膜:取自电缆内侧缘，擦洗干净，裁剪成1 cm×0.5 cm大小，分别经碘伏、75%酒精浸泡24 h，经培养证实无菌。③植入物准备:在超净台内，将薄膜轻柔卷曲，置入导管内。在植入大鼠体内前1 d，置于胎牛血清中37℃孵育过夜。再将血清中的特制导管取出，用无菌PBS液漂洗2遍。放入提前制备好的菌悬液中，37℃孵育4 h。

动物模型的构建 ①动物准备:实验前3 d开始免疫抑制，按50 mg/kg的剂量腹腔注射，直至实验结束。②导管置入:大鼠背部切口1～1.2 cm，剥离皮下组织，游离皮肤，形成2 cm以上的腔管。放入提前制备好的导管，每只大鼠体内放入3个，缝合皮肤。③创口维护:每天2次观察伤口感染情况，用无菌生理盐水清洗创口，并用碘伏消毒。④移除导管:分别在植入后24 h、48 h、72 h，在无菌条件下将导管取出，取出导管内薄膜，倒置显微镜下观察生物膜形成情况。

形态观察 将取出的导管经PBS洗涤3次后，置于10%多聚甲醛液中室温固定过夜，经脱水等处理后分别进行直接普通光学显微镜和扫描电子显微镜(SEM)观察。

活性检测 将生物膜自大鼠体内取出后，经PBS洗涤3次后放置于24孔板中，加入2 mL DMEM液体培养基，加入 MTT 200 μL，37℃孵育4 h后取出，弃除培养液，加入150 μL DMS0，置于摇床上匀速混匀10 min后弃除DMSO，置于酶标仪中，在490 nm处检测吸收值。各孔OD值与调零孔平均值之差代表各孔生物膜的代谢活性。

统计分析所获得的数据均用(±s)表示，采用SPSS 11.0进行统计分析，各时间点实验组同对照组间数据进行LSD-T检验;实验组各时间点间数据进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-T检验。

2 结 果

2.1 形态观察

直接镜检和扫描电镜结果均显示生物膜经历黏附、聚集、微菌落形成及外分泌基质的释放和包裹过程，最终形成了拉丝状的基质将菌体包裹住的团块 (见图1)。

2.2 体内新生隐球菌生物膜活性

MTT法检测显示实验组同对照组比较具有统计学意义(P＜0.05)，提示采用大鼠构建新生隐球菌体内生物膜模型时需对大鼠进行免疫抑制;同时，新生隐球菌体内生物膜活性检测显示随着时间的增长，体内生物膜活性逐渐增强(见图2)。

3 讨 论

随着置管术等创伤性诊疗技术的广泛应用及开展，HIV/AIDS的患病率和发病率的不断上升，肿瘤等恶性疾病的增多，以及器官移植术的全面推广以及免疫抑制药物的大量应用，病原真菌尤其是侵袭性病原真菌导致的患病率与发病率呈不断上升的态势，使得临床工作面临巨大的挑战［5］。作为一种重要的临床致病真菌，新生隐球菌在侵袭性真菌感染中有着重要的地位。其主要引起免疫力低下人群或部分免疫正常人群的中枢神经系统感染，导致致命的新生球菌性脑膜炎，在缺乏及时正确的抗真菌治疗的情况下，致死率可高达90%以上［6］。抗真菌药物的缺乏以及真菌耐药的产生，使得临床抗真菌治疗工作更加困难。真菌耐药常由以下几个原因:菌种突变，新型致病真菌的产生以及生物膜形成。其中，真菌生物膜形成是导致临床上真菌耐药性的主要机制之一。1986年Waltham自1例冠脉搭桥术患者的导管中观察到形成生物膜的新生隐球菌，证实新生隐球菌形成生物膜的可能［7］。

图1 新生隐球菌体内生物膜形态观察结果 (a.×200，b.×200，c.×200，d.×500，e.×200，f.×500);a-c.直接镜检结果，d-f.扫描电镜结果;a，d.新生隐球菌少量附着于导管内壁;b，e.附着于内壁的菌体不断聚集，形成微菌落;c，f.菌体分泌外基质，将菌体包裹 图2 不同时间点体内新生隐球菌生物膜活性(*.P＜0.05)Fig.1 Images of C.neoformans biofilm morphology in vivo(a.×200，b.×200，c.×200，d.×500，e.×200，f.×500);a-c.The direct light microscopy images of the C.neoformans biofilm in vivo;d-f.The SEM images of the C.neoformans biofilm in vivo;a，d.Several C.neoformans cells adhesion to the inner side of the catheter;b，e.The yeast cells adhered to the inner side of the catheter contious assembling and developing microcolony;c，f.Cells in the biofilm was wrapped up by the extracellular matrix(ECM)secreted by the yeasts Fig.2 C.neoformans biofilm vitability at different time points(*.P ＜0.05)

生物膜的形成是一个多步生长行为，涉及复杂的物理、化学和生物过程［8］。生物膜主要在外源性有机移植物表面形成，例如:假牙组织、导管等有机材料［9］。因此体外多以PVC等有机材料为支持物构建体外生物膜模型。但是由于体外模型不能完全模拟体内复杂的内环境，构建体内模型就显得尤为重要。

2004年，D Andes等［10］成功构建大鼠中心静脉管皮下置管白念珠菌生物膜体内模型，为研究生物膜体内耐药等提供有效平台。徐瑞宏等［11］所建立的新生隐球菌新西兰兔中心静脉置管生物膜模型同样建立了有效的隐球菌生物膜体内感染模型研究模型。但该模型在构建过程中需要采用中心静脉置管术，对于术者的操作能力要求较高，不便于开展样本量较大的实验研究。本文所建立的大鼠模型，操作方便，可独立进行并完成整个实验。同时，通过MTT法进行体内生物膜活性进行检测，通过定量的方法对生物膜的活性进行鉴定，与体外实验结果一致［12］。本工作将为后续研究新生隐球菌的毒性因子及耐药机理提供提有效的基础。

［1］Costerton JW.Overview of microbial biofilms［J］.J Ind Microbiol，1995，15(3):137-140.

［2］Ramage G，Mowat E，Jones B，et al.Our current understanding of fungal biofilms［J］.Crit Rev Microbiol，2009，35(4):340-355.

［3］Donlan RM.Biofilms:microbial life on surfaces［J］.Emerg Infect Dis，2002，8(9):881-890.

［4］Donlan RM.Biofilm formation:a clinically relevant microbiological process［J］.Clin Infect Dis，2001，33(8):1387-1392.

［5］Warnock DW.Fungal diseases:an evolving public health challenge［J］.Med Mycol，2006，44(8):697-705.

［6］Burkle CM，Harrison BA，Koenig LF，et al.Morbidity and mortality of deep sedation in outpatient bone marrow biopsy［J］.Am J Hematol，2004，77(3):250-256.

［7］Waltham MC，Cornell BA，Smith R.Association of ferri-and ferro-cytochrome c with lipid multilayers:a 31P solid-state NMR study［J］.Biochim Biophy，1986，862(2):451-456.

［8］Cos P，Tote K，Horemans T，et al.Biofilms:an extra hurdle for effective antimicrobial therapy［J］.Curr Pharm Des，2010，16(20):2279-2295.

［9］Mah TF.Biofilm-specific antibiotic resistance［J］.Fut Microbiol，2012，7(9):1061-1072.

［10］Andes D，Nett J，Oschel P，et al.Development and characterization of anin vivocentral venous catheterCandida albicansbiofilm model［J］.Infect Immun，2004，72(10):6023-6031.

［11］徐瑞宏，方伟，廖万清.新生隐球菌生物膜动物模型构建及PMT4对生物膜形成的影响［J］.中国真菌学杂志，2009，4(4):198-210.

［12］Ravi S， Pierce C， Witt C， et al. Biofilm formation byCryptococcus neoformansunder distinct environmental conditions［J］.Mycopathol，2009，167(6):307-314.