福州市发生由木尔坦棉花曲叶病毒引起的朱槿曲叶病

章松柏， 夏宣喜， 张 洁， 张友军， 吴祖建＊

（1.福建农林大学植物病毒研究所，福州 350002；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.长江大学农学院，荆州 434025）

棉花曲叶病（cotton leaf curl disease）是世界棉花生产上最具毁灭性的病毒病害，已在巴基斯坦、印度、苏丹、埃及和南非等国棉花产区广泛流行，仅在1992－1997年期间就造成巴基斯坦经济损失累计达50亿美元［1－4］。棉花曲叶病是多种双生病毒引起，这些双生病毒都属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）成员［3，5－6］，皆由烟粉虱［Bemisia tabaci （Genn.）］以持久方式传播，也可以嫁接传播，但不能通过机械摩擦接种传播和种子带毒传播；其基因组仅含有DNA－A组分，并伴随卫星β分子［3－4］。鉴于棉花曲叶病的危害性，2007年5月28日正式发布实施的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，再次将其列入植物检疫对象。尽管如此，棉花曲叶病的主要病原之一，木尔坦棉花曲叶病毒，还是很快在我国朱槿（Hibiscus rosa－sinensis Linn.）植物上被发现［7］，经过不到8年的扩散，该病毒已经在我国广东、广西、海南等省多个地理区域的多种植物上流行危害，其他省市，包括我国长江流域、黄河流域和西北内陆三大棉花产区尚未发现棉花曲叶病［7－11］。因此，密切监视和防控CLCuMV引起的病害扩散是各级植保植检部门和科研工作者的重要任务。2011－2012年，实验室科研人员先后于福建省厦门、福州、宁德等市公路绿化带发现朱槿曲叶病疑似病株，并详细调查了该病在福州市的发生情况。经过调查发现福州市城市道路、公园、工厂、学校、政府机关等多数存在朱槿植物的绿化带以及位于市郊的绝大多数苗圃基地皆存在疑似病株，经过分子检测和序列比较，证实该病害病原为木尔坦棉花曲叶病毒，传毒介体为B型烟粉虱，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

植物样品：朱槿曲叶病疑似病株叶片和健株叶片采集于福州市郊区苗圃基地，液氮速冻后保存于－70℃超低温冰箱中备用，阳性对照样品为已经鉴定的苎麻花叶病毒病病株。

介体昆虫：烟粉虱种群分别采自福州市郊区朱槿健株和疑似病株以及烟草上，收集于含75%乙醇的1.5mL离心管中，保存于－70℃超低温冰箱或－20℃冰箱中备用。

1.2 实地调查和症状观察

调查福州市种植朱槿的公园、道路、单位和苗圃基地，走访苗圃基地花农，记录朱槿曲叶病的发生时间和可能的传入途径；对照健康植株，观察发病朱槿植株叶片是否畸形和黄化，叶片大小是否变化，叶背有无耳突，叶脉是否增厚等，植株是否矮化等。

1.3 植物总DNA和烟粉虱DNA的提取

采用周雪平等报道的CTAB提取法［12］提取朱槿叶片中的总DNA（总共有14份植物样品，包括病叶样品12份、健叶样品1份，对照样品1份）。

烟粉虱生物型的鉴定使用多头昆虫（30～50头）提取的DNA，方法如下：将烟粉虱置于1.5mL离心管中，液氮速冻后，用研磨棒研磨成粉状，加入含200μL 碱 裂 解 液 （50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，20mmol／L NaCl，1mmol／L EDTA，1%SDS）和1μL蛋白酶K（终浓度1μg／mL），55℃水浴锅中水浴2～3h；离心（12000r／min，下同）5min后取上清，加入200μL 24∶1的氯仿／异戊醇抽提，重复1次；离心5min后取上清，加入等体积的异丙醇，－20℃放置20min；离心10min，去上清，沉淀用70%乙醇洗1次，然后将DNA沉淀室温晾干，加入60μL ddH2O溶解后即可用于PCR反应。烟粉虱带毒率监测使用朱槿曲叶病病株上采集的烟粉虱，单头烟粉虱总DNA的提取方法参照潘慧鹏等［13］。

1.4 PCR扩增和电泳

利用Shatters等［14］基于B型和Q型烟粉虱mtDNA COⅠ基因片段设计的PCR扩增特异性引物来鉴定烟粉虱的生物型是B型还是Q型；利用谢艳等［15－16］设计的双生病毒通用引物来检测福州朱槿曲叶病是否由双生病毒引起，并在序列分析的基础上设计扩增DNA－A余下片段的引物。PCR热循环程序为：94℃4min，94℃20s，55℃20s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0%琼脂糖（0.5×TBE）电泳检测，BioRad凝胶成像仪观察，记录结果。

1.5 检测片段克隆和序列分析

双生病毒通用引物PCR扩增所得的检测片段连接pMD 18－T （TaKaRa），转化克隆验证后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。运用DNAMAN软件（Lynnon Biosoft Inc.）对所获序列进行加工整理和同源性分析。

2 结果与分析

2.1 福州市朱槿曲叶病危害现状

通过与苗圃基地花农们座谈得知，福州朱槿苗木最初由广东调运而来，随后经过枝条扦插繁殖而扩大种植；朱槿疑似曲叶病最早发生于2009年，当时只有零星苗圃发生，经过3年时间已经扩散至福州市各苗圃基地、多数绿化带以及周边县市。因此，推测该病随苗木调运而传入福州地区。福州市朱槿曲叶病发病症状和已报道的朱槿曲叶病症状一致，如封面所示：发病朱槿植株和枝条都明显矮化；新叶黄化明显；叶片畸形，变小，老叶和新叶皆向上卷曲，呈杯状或勺状；叶脉增大、明脉或脉突，叶片背面粗糙不平且于叶脉处产生耳突；较大的朱槿病株都能正常开花，但花较健康略小，但较小的苗木多数不能正常开花。

2.2 朱槿曲叶病的PCR检测和鉴定

应用双生病毒的通用引物（PA／PB）对检测样品进行PCR扩增，样品1～12号都能得到预期约480bp大小的片段（见图1）。选择样品1～6进行测序，检测片段的序列完全一致。在此基础上设计引物扩增DNA－A余下约2260bp片段（以样品1～6的总DNA为模板，扩增结果如图1中13～18泳道），并予以测序。DNA－A全长序列（GenBank登录号：JX861210）分析比较如图2所示，在引起棉花曲叶病的8种病毒中，检测样品的DNA－A序列与CLCuMV相似性最高，其中与CLCuMV广东分离物（JX286664）和广西分离物（JQ317603）的相似性高达99.6%以上，说明引起福州朱槿曲叶病的病原是CLCuMV。

图1 福州朱槿曲叶病的PCR检测及DNA－A的扩增Fig.1 PCR detection of leaf curl disease on H.rosa－sinensis plants and PCR amplification of the geminivirus DNA－A

图2 基于双生病毒的DNA－A核酸全序列构建的亲缘关系树Fig.2 Phylogenetic tree based on complete sequence of Begomovirus DNA－A

2.3 烟粉虱生物型鉴定和烟粉虱带毒率检测

烟粉虱生物型鉴定应用相应的特异性引物进行PCR扩增，结果如图3所示，用鉴定B型烟粉虱的特异性引物PCR扩增能得到预期的、约480 bp大小的DNA产物（B1～B6），而用鉴定Q型的特异性引物进行PCR扩增，未得到预期的、约300bp大小的DNA带条（Q1～Q6），说明采集于烟草和健康或发病朱槿上的烟粉虱生物型是B型。

朱槿病株上烟粉虱的带毒率应用引物PA／PB进行PCR扩增，以已经鉴定的病株和健株上采集的烟粉虱分别做阳性和阴性对照，结果如图4所示。22头朱槿病株上采集的烟粉虱样品PCR扩增皆能得到预期的、约480bp大小的DNA条带，所检测的烟粉虱带毒率100%，说明烟粉虱的带毒效率很高。

3 讨论

试验证实福州市朱槿曲叶病是由CLCuMV侵染引起的。CLCuMV是引起棉花曲叶病的主要病原之一，而棉花曲叶病是棉花生产上最具毁灭性的病毒病害，多次在巴基斯坦、印度、苏丹、埃及和南非等国棉花产区暴发流行，造成巨大的经济损失［3－4］。已报道从棉花曲叶病样中检测到8种双生病毒［3，8］，分别为木尔坦棉花曲叶病毒（CLCuMV）、阿拉巴德棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Alabad virus，CLCuAV）、Kokhran棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Kokhran virus，CLCuKV）、番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl virus，PaLCuV）、杰济拉棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Gezira virus，CLCuGV）、拉贾斯坦棉花曲叶病毒 （Cotton leaf curl Rajasthan virus，CLCuRV）、班加罗尔番茄曲叶病毒 （Tomato leaf curl Bangalore virus，ToLCBV）和布里瓦拉棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Burewala virus，CLCuBuV），这8种病毒在自然条件下由烟粉虱以持久方式传播，也可以嫁接传播，不能通过其他方式传播，自然寄主包括棉花、黄秋葵、朱槿、垂花悬铃花和蔟生黄麻等植物［8］。目前，我国长江流域、黄河流域和西北内陆三大棉花产区尚未发现棉花曲叶病毒危害，但在广东、广西、海南3省已经发现CLCuMV危害朱槿、黄秋葵等植物，危害范围日益扩大［7－11］。与广西情况相似［8］，福建的朱槿苗木最初也是主要来源于广东，经过若干年的发展，朱槿已经成为城市公路、公园、工厂、学校、政府机关等常用的绿化植物。由于CLCuMV福州分离物DNA－A与广东分离物的相似性高达99.6%以上，推测CLCuMV可能是通过朱槿的苗木调运而从广东省入侵福建省的。入侵后的CLCuMV经过B型烟粉虱在苗圃间传播，同时病枝扦插繁殖、苗木交易加速了病毒病的发生和蔓延扩散。更为重要的是，朱槿和棉花同属锦葵科，且我国广西已经发现有CLCuMV危害棉花的报道［17］，如果该病毒分离物一旦入侵棉区，势必造成严重后果。此外，试验也验证了福州市朱槿曲叶病病株上烟粉虱的生物型是B型，该生物型是我国烟粉虱种群中的优势种，南北多数省市均有分布，携带和传播棉花曲叶病毒的能力较强。因此有必要在广东、广西、海南、福建等省开展对木尔坦棉花曲叶病毒引起的植物病害综合治理研究，以控制其扩散和蔓延，特别要警惕CLCuMV随烟粉虱传播、扩散至内陆棉区暴发流行。

［1］ Goodman R M.Single－stranded DNA genome in a whiteflytransmitted plant virus［J］.Virology，1977，83（1）：171－179.

［2］ Boulton M I.Geminiviurses：Major threats to world agriculutre［J］.Annals of Applied Biology，2003，142（2）：143.

［3］ Amjad Farooq，Jehanzeb Farooq，Abid Mahmood，et al.An overview of Cotton leaf curl virus disease（CLCuD）a serious threat to cotton productivity［J］.Australian Journal of Crop Science，2011，5（13）：1823－1831.

［4］ Briddon R W，Markham P G.Cotton leaf curl virus disease［J］.Virus Research，2000，171（1－2）：151－159.

［5］ Fauquet C M，Briddon R W，Brown J K，et al.Geminivirus strain demarcation and nomenclature［J］.Archives of Virology，2008，153（4）：783－821.

［6］ 洪健，李德葆，周雪平.植物病毒分类图谱［M］.北京：科学出版社，2001：28－38.

［7］ 毛明杰，何自福，虞皓，等.侵染朱槿的木尔坦棉花曲叶病毒及其卫星 DNA全基因组结构特征［J］.病毒学报，2008，24（1）：64－68.

［8］ 何自福，佘小漫，汤亚飞.入侵我国的木尔坦棉花曲叶病毒及其为害［J］.生物安全学报，2012，21（2）：87－92.

［9］ 董迪，朱艳华，何自福，等.侵染广东黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒及伴随卫星DNA的分子特征［J］.华南农业大学学报，2012，33（1）：33－39.

［10］何自福，董迪，李世访，等.木尔坦棉花曲叶病毒已对我国棉花生产构成严重威胁［J］.植物保护，2010，36（2）：147－149.

［11］林林，蔡健和，罗恩波，等.南宁市朱槿曲叶病毒病病原分子鉴定和寄主范围研究［J］.植物保护，2011，37（4）：44－47.

［12］周雪平，戚益军，李德葆.从棉花组织中提取棉花曲叶病毒基因组 DNA之方法［J］.农业生物技术学报，1999，7（2）：169－172.

［13］潘慧鹏，戈大庆，王少丽，等.在北京和河北局部地区Q型烟粉虱取代了B型烟粉虱［J］.植物保护，2010，36（6）：40－44.

［14］Shatters R G J，Powell C A，Boykin L M，et al.Improved DNA barcoding method for Bemisia tabaci and related Aleyrodidae：development of universal and Bemisia tabaci biotypespecific mitochondrial cytochrome c oxidase I polymerase chain reaction primers［J］.Journal of Economic Entomology，2009，102（2）：750－758.

［15］Zhou X P，Xie Y，Zhang Z K.Molecular characterization of a distinct begomovirus infecting tobacco in Yunnan，China［J］.Archives of Virology，2001，146（8）：1599－1606.

［16］Xie Y，Zhou X P.Molecular characterization of squash leaf curl Yunnan virus，a new begomovirus and evidence for recombination［J］.Archives of Virology，2003，148（10）：2047－2054.

［17］Cai J H，Xie K，Lin L，et al.Cotton leaf curl Multan virus newly reported to be associated with cotton leaf curl disease in China［J］.Plant Pathology，2010，59，（4）：794－795.