M细胞靶向肽对FaeG抗原的免疫增强作用

高 菲，崔 文，姜艳萍，唐丽杰，葛俊伟，李一经

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是新生仔猪和断奶仔猪腹泻的(Porcine post-weaning diarrhea，PWD)主要原因之一， ETEC引起腹泻主要是通过其表面的菌毛黏附素(F4、F5、F6和F41等)吸附于肠道上皮细胞，然后产生肠毒素而致病。ETEC的菌毛和肠毒素被认为是最主要的致病因素，其中菌毛与小肠上皮结合是感染及致病的关键环节。阻止ETEC定殖，将有可能预防PWD的发生。

FaeG是黏附素蛋白F4的主要蛋白的亚基，位于菌毛的顶端，直接参与易感宿主肠上皮细胞大分子受体的特异性结合[1]，已成为预防PWD的疫苗候选抗原。

肠道内大多数抗原是通过M细胞转运，其胞吞转运作用是Peyer's结获取抗原的主要来源。研究表明，将抗原靶向传递至M细胞，可以提高Peyer's结的抗原摄取量，激活更多的T、B细胞参与免疫反应。靶向肽co1能够有效的将融合蛋白传递给M细胞，增强免疫反应，与LTB、CTB相比，co1对融合蛋白的大小没有限制，不会影响抗原蛋白的正常组装，可以重复用于免疫[2-3]。

本实验通过PCR的方法扩增FaeG-co1融合基因，通过原核表达制备融合蛋白，免疫小鼠后，经E.coli强毒株攻毒，通过对比M细胞靶向修饰组和未修饰组IgG、sIgA抗体水平的变化及其对小鼠的免疫保护情况，检测M细胞靶向肽co1对FaeG疫苗免疫原性的影响，为进一步研究其基因工程疫苗提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株和质粒 ETEC cvcc230菌株购自中国兽药监察所；E.coli BL21(DE3)和表达载体pET-30b由本实验室保存；感受态JM 109和pMD18-T载体购自TaKaRa公司。

1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶，Taq DNA聚合酶、dNTP、T4DNA连接酶、Protein Marker购自TaKaRa公司；小量质粒纯化及胶回收试剂盒购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；氢氧化铝胶购自哈药集团生物疫苗有限公司；FaeG多克隆抗体由刘文鑫博士惠赠[4]；羊抗鼠HRP-IgG、HRP-IgA、羊抗鸡HRP-IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验动物 体质量为18g～20g，6周龄～8周龄昆明鼠，清洁级，购自哈尔滨兽医研究所，饲养于P2实验室的动物感染室IVC中。

1.4 目的基因的克隆与鉴定 根据已发表的ETEC基因序列(CP002732)，设计并合成PCR扩增FaeG基因的上下游引物，引物序列分别是P1：5'-GGAT CCATGGATGACTGGTGA-3'(Bam HⅠ)；P2：5'-CT CGAGGTAATAAGTAATTGCT-3'(XhoⅠ)；根据报道[2]，设计合成一条编码M细胞靶向肽co1基因序列作为引物P3：(SalⅠ)5'-GTCGACCGGCAGAGGC GACCGCGCCGGCAGCTGATGAAACGACTCGAG-3'(XhoⅠ)，用于扩增FaeG-co1融合基因。以ETEC全基因组DNA为模版，以P1和P2扩增FaeG基因，将FaeG胶回收并将其作为模版，以P1和P3作为引物扩增FaeG-co1基因。扩增条件为：95℃5m in；94℃ 40s、53℃ 40s、72℃ 60s，30个循环；72℃10min。分别将FaeG和FaeG-co1的胶回收产物克隆于pMD18-T中构建重组质粒pMD-FaeG和pMD-FaeG-co1，并进行测序鉴定。

1.5 重组菌的构建、诱导表达及鉴定 采用Bam HⅠ和XhoⅠ对pMD-FaeG和pET30b进行双酶切，Bam HⅠ和SalⅠ对pMD-FaeG-co1进行双酶切，回收目的片段，将目的基因亚克隆于pET-30b表达载体中，转化至受体菌，构建重菌株pET-FaeG/BL21(DE3)、pET-FaeG-co1/BL21(DE3)。将重组菌扩大培养，当OD600nm约为0.4时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃摇床180r/m in诱导4h，离心收集菌体进行超声破碎，离心后收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE分析，确定表达蛋白的存在形式。将重组菌经SDS-PAGE分析后转印于硝酸纤维素膜，5%脱脂乳4℃封闭过夜。以FaeG多抗作为一抗，羊抗鸡HRP-IgG为二抗，通过二氨基联苯胺(DAB)显色进行western blot鉴定。

1.6 包涵体制备 经IPTG诱导的重组菌培养物离心收集菌体，重悬于50mmol/L Tris·HCl 22mmol/L EDTA中，加入溶菌酶至终浓度100μg/m L，再加入 0.5m L 1%Triton X-100，于 30℃温育 30m in。经超声波裂解10min后，12000r/min离心15min，收集沉淀物，重悬后备用。以提取的包涵体为材料，按Bioteke说明书纯化蛋白。

1.7 小鼠最小致死剂量(MLD)的确定 用LB培养基将ETEC cvcc230菌液分别稀释为1.0×107cfu/m L、5.0×107cfu/m L、1.0×108cfu/m L、5.0×108cfu/m L、1.0×109cfu/m L、5.0×109cfu/m L 6个不同浓度，分别口服接种6组小白鼠，每组5只，每只0.2m L，接种后观察小鼠的死亡状况，确定MLD。

1.8免疫保护性试验 将FaeG、FaeG-co1包涵体悬液，分别加等量的氢氧化铝胶混均后通过腹腔途径免疫小鼠，每组10只，每只50μg，设立注射生理盐水对照组。14d后以相同剂量和接种途径进行加强免疫；在第二次免疫14d后，口服接种1MLD的E.coli强毒株进行攻毒试验。攻毒后对小鼠进行监测，统计其发病和死亡情况。

1.9 免疫小鼠特异性IgG、sIgA测定 分别采集免疫前、初次免疫后第7d、21d以及攻毒后第7d血液及小鼠粪便，制备血清，每0.1g粪便加入0.5m L提取液，振荡30min，10000r/min离心5min，收集上清，采用间接ELISA方法检测抗体效价。方法如下，以FaeG蛋白包被ELISA反应板0.1μg/孔，4℃反应过夜；洗涤3次后用含有5%脱脂乳的PBST液37℃封闭2.5h；洗涤后分别加入1∶6400稀释的小鼠血清、处理好的粪便上清，37℃反应1h；分别加入1∶5000稀释的羊抗鼠HRP-IgG、HRP-IgA，37℃反应1h；加OPD-H2O2底物显色液，避光显色10m in，加终止液测定OD490nm。

2 结果

2.1 FaeG及FaeG-co1基因的克隆与鉴定 以ETEC全基因组DNA为模板，P1、P2为引物，经PCR扩增获得约813bp的FaeG基因，以FaeG基因胶回收产物为模版，P1和P3(co1基因序列)为引物，通过重叠延伸PCR(EOS-PCR)扩增获得约846bp的FaeG-co1基因，经过比对与GenBank上已发表的序列的核苷酸同源性为98%～100%。

2.2 重组菌的构建、诱导表达与鉴定 分别构建重组表达质粒pET-FaeG、pET-FaeG-co1，其重组菌诱导后，经SDS-PAGE分析，表达的重组蛋白分子量分别约为34.6ku和36.8ku(图1)。两种重组菌表达的蛋白均主要以包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示，目的蛋白可被阳性血清识别，显示其具有良好的免疫反应性(图2)。

2.3 免疫保护性试验 测定用于攻毒的ETEC cvcc230菌株LD50为1.0×109cfu/m L。攻毒后对各组小鼠进行连续监测，结果表明，非免疫攻毒对照组小鼠在第2d全部死亡；FaeG组小鼠在攻毒后第2d出现临床症状，有2只小鼠分别在第4d、5d死亡，从7d开始临床症状减轻，第12d恢复正常；FaeG-co1组小出现轻度的临床症状，第7d恢复正常。最终统计保护率：FaeG组为80%(8/10)、FaeG-co1组为100%(10/10)。结果显示co1靶向肽能够增强FaeG-co1融合蛋白的免疫原性(图3)。

2.4 免疫小鼠抗ETEC特异性IgG、s IgA水平对比ELISA结果显示，各组小鼠均可在第7d检测到有特异性IgG、sIgA抗体产生，与对照组相比差异极显著(p<0.01)，并且FaeG-co1组与FaeG组抗体水平差异显著(p<0.05)。FaeG-co1组在第21d与FaeG组间抗体水平差异极显著(p<0.01)。攻毒后抗体水平明显上升，FaeG-co1组与FaeG组间抗体水平差异极显著(p<0.01)。表明co1靶向肽修饰组的可提高抗体产生水平明显(图4和图5)。

3 讨 论

目前，控制PWD主要依靠抗生素，然而长期依赖抗生素最终导致多重耐药菌株的出现以及生产成本过高等问题。到目前为止，全球范围内还没有十分有效的PWD疫苗，所以如何有效的预防幼畜腹泻成为了亟待解决的问题。

F4+ETEC感染能够引起新生仔猪和断奶仔猪的腹泻和死亡。F4可以介导ETEC与小肠上皮细胞刷状缘上的受体结合，从而使ETEC在肠道内定植并大量繁殖，引起水样腹泻[5]。研究表明，对母猪进行免疫可以保护初生仔猪免受感染，但这种被动免疫力在断奶后并不能有效的抵抗病原微生物的侵袭。因此，通过疫苗免疫建立仔猪主动免疫应答对预防PWD等多发性传染病具有重要的意义。

M细胞主要存在于派伊尔氏集合淋巴结(Payer's patches)中的滤泡相关上皮细胞、孤立淋巴结、胃肠道外的黏膜相关淋巴组织，是一种特殊的抗原转运细胞，是启动黏膜免疫应答的第一步[6-7]。通过将抗原靶向至M细胞可以提高抗原提呈细胞对抗原的摄取量，从而激活更多的T细胞参与免疫反应，诱导仔猪动物更早、更快的产生更强的免疫应答。

F4菌毛是F4+ETEC黏附于肠道上皮细胞的关键性致病因子，也是抗F4+ETEC腹泻基因工程疫苗研制中广泛使用的靶抗原。以纯化F4菌毛蛋白[8]、重组FaeG蛋白[9]、F4蛋白肠溶微丸[10]、植物反应器表达的FaeG蛋白作为免疫原免疫哺乳仔猪[11-12]，可以诱导一定程度黏膜免疫应答和系统免疫应答，虽不能完全阻止感染的发生，但产生的抗体具有抗F4+ETEC黏附作用。

本研究表达的FaeG和FaeG-co1融合蛋白的包涵体分别免疫昆明鼠并进行攻毒试验。结果表明，FaeG-co1融合蛋白可以有效诱导小鼠产生的特异性IgG、sIgA抗体水平，并显著高于FaeG免疫组；而且FaeG-co1组两次免疫后对E.coli强毒株致死剂量攻毒保护率达到100%，明显高于FaeG免疫组的80%。结果表明，M细胞靶向肽co1在肠道外免疫也同样具有免疫增强作用，可使动物在短时间内产生更高水平的抗体，提高免疫应答的水平，是一种极具应用前景的免疫增强分子。

蛋白的提纯物可激发小鼠产生高水平保护性抗体的免疫应答，但其提纯工艺较为复杂、损失率较大，不适用于大规模生产。而包涵体蛋白由于不具有天然蛋白的构象，不具有相应的蛋白生物活性，但它却是有效的免疫原[15]，而且更利于对其进行纯化[13]。实验结果表明，用提取的包涵体直接免疫小鼠同样获得了理想的免疫效果。

本实验通过co1对F4菌毛的主要亚单位FaeG进行融合表达，用氢氧化铝作为佐剂，包涵体直接免疫动物，两次免疫即可获得100%的攻毒保护率，有效的提高了免疫效果，并降低了生产成本。本研究为制备防治PWD的基因工程疫苗奠定了基础，也为研究疾病的早期免疫提供了新思路。

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