金黄色葡萄球菌毒力因子PSM-α的4个基因串联融合表达及其对人中性粒细胞的生物学作用

刘丽慧，温 峻，袁 鹏，史祺云，金琨琪，程 威，于 录*，冯海华*

(1.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062；2.吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林长春130062)

金黄色葡萄球菌(S.aureus)是人类常见的病原菌，感染后可以引起肺炎、心内膜炎、骨髓炎甚至败血症[1]。由于抗生素滥用，S.aureus对多种抗生素产生了耐药性[2]。特别是近年来出现的社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)[3-4]，因其直接或间接的与健康医疗设施相关，已成为最重要的公共卫生问题之一[5]。

酚可溶性调控蛋白(Phenol-soluble modulin，PSM)是最新发现的一种细胞外分泌蛋白，它在不需受体介导的条件下即具有细胞裂解能力，是逃避中性粒细胞的重要毒力因子；PSM还具有趋化功能，并能够诱导中性粒细胞释放细胞因子，引发炎症反应[6-7]。PSM由核基因编码并且基因成簇存在，可分为 α-肽(-20～25个氨基酸)和 β-肽(-45个氨基酸)，具有两亲性 α-螺旋结构。其中，α-肽包括PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3和 PSM-α44种 亚 型 ，β-肽由β1和β2组成。David等研究表明，当敲除PSM-α后，S.aureus的致病力明显降低，而敲除PSM-β后未见致病力的明显变化[8]，表明PSM-α是S.aureus致病的主要毒力因子。本实验串联融合表达PSM-α蛋白，采用纯化的蛋白刺激健康人的中性粒细胞，通过ELISA检测IL-1β及IL-8的含量，鉴定其对中性粒细胞的影响，为制备抗体及为S.aureus感染的有效控制和临床治疗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 大肠杆菌BL21(DE3)及表达载体pGEX-4T-1均为本实验室保存；限制性内切酶SalⅠ、Bam HⅠ及T4连接酶均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒及DNA片段纯化回收试剂盒购自Axygen；还原型谷胱甘肽(GSH)购自上海鼎国生物技术有限公司；人中性粒细胞分离液Polymorphprep购自AXIS-SHIELD PoC AS；纯化柱及 Glutathione Sepharose 4B购自GE公司；凝血酶购自生工生物工程(上海)有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；小鼠抗谷胱甘肽-S-转移酶(GST)抗体购自长春宝泰克生物科技公司；过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体、Hepes缓冲液均购自武汉博士德生物工程有限公司；ELISA试剂盒购自e-Bioscience。

1.2 表达重组质粒pGEX-PSM-α的构建 根据GenBank中登录的PSM-基因序列(BK006301.1)，通过 linker将 PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3、PSM-α44个基因(图1)串联于pUC-50T载体中(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，SalⅠ及Bam HⅠ双酶切目的片段，经DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，连接表达载体pGEX-4T-1，转化感受态BL21(DE3)。培养后，提取重组质粒双酶切鉴定并测序鉴定。

1.3 PSM-α蛋白表达条件优化及鉴定 将重组菌37℃培养至OD600nm值为0.4～0.6，分别加入0.2mM～1mM IPTG，诱导温度分别为16℃～37℃，转数分别为180r/min～220r/m in，诱导时间分别为2h～12h，经SDS-PAGE分析确定最佳诱导条件。以优化条件大量诱导表达蛋白，收集菌体并超声裂解，离心后将收集沉淀及上清分别进行SDS-PAGE及western blot鉴定。

1.4 PSM-α蛋白纯化、酶切及SDS-PAGE鉴定按照Glutathione Sepharose 4B Affinity操作说明书纯化表达蛋白、凝血酶酶切(切除GST标签)，获得的蛋白分别进行SDS-PAGE鉴定。

1.5 人中性粒细胞的分离 按照Polymorphprep说明书分离健康人外周静脉血(EDTA-K2抗凝处理)中性粒细胞，重悬于RPM I-1640培养基中。

1.6 细胞毒性检测 将分离的中性粒细胞按1×104cells/孔培养于96孔板中，实验组中加入纯化后酶切处理的重组蛋白，使其终浓度分别为10μg/m L、1μg/m L、100ng/m L、10ng/m L，同时设置空白孔及阴性对照孔，分别培养 2h、4h、6h，根据CCK-8操作说明书测定不同浓度蛋白对细胞存活率的影响，计算公式为：细胞存活率(%)=(实验组A均值-空白孔A值)/(对照孔A值－空白孔A均值)×100%。

1.7 ELISA检测 将分离的中性粒细胞按1.5×105cells/孔培养于96孔板中，实验组加入纯化后酶切处理蛋白，使其终浓度为10μg/m L，置于37℃5%CO2培养6h[9]，收集上清，通过ELISA检测IL-1β及 IL-8的含量(e-Bioscience)。

1.8 统计学分析 采用SPSS 13.0对实验所得数据进行统计学分析。

2 结果

2.1 pGEX-PSM-α表达重组质粒的构建及鉴定通过人工合成由linker连接编码PSM-α4个基因(PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3、PSM-α4)的串联融合基因，并克隆于pGEX-4T-1载体中，构建表达重组质粒pGEX-PSM-α，经SalⅠ及Bam HⅠ双酶切后，得到306bp目的片段(图2)，测序结果与预期相符。

2.2 PSM-α 蛋白 SDS-PAGE及 western blot鉴定 用不同诱导条件诱导表达蛋白，超声裂解离心后收集沉淀及上清，经western blot试验表明其具有免疫原性(图 3)。以优化条件 1mM IPTG，16℃220r/m in诱导12h，大量表达分子量为36ku的可溶性蛋白。

2.3 PSM-α蛋白纯化及酶切结果 诱导表达后蛋白经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化得到36ku的蛋白，纯化后蛋白经凝血酶切除GST标签后得到10ku重组蛋白(图4)。

2.4 细胞毒性检测结果 用纯化后酶切处理的PSM-α蛋白作用于分离的中性粒细胞，通过CCK-8试剂盒检测不同蛋白浓度、不同作用时间对细胞存活率的影响(图5)，结果表明当蛋白浓度为10μg/m L、作用6h后，对细胞的毒性为10%(将该浓度作为该蛋白对细胞的基本无毒浓度)。

2.5 ELISA检测结果 采用ELISA方法检测IL-1β及IL-8，结果表明PSM-α蛋白刺激中性粒细胞后，空白组IL-8仅为74pg/m L，实验组IL-8含量平均为918pg/m L，差异极显著(p<0.01)；对照组 IL-1β(16pg/m L)与实验组(45pg/m L)相比差异不显著。

3 讨 论

PSM-α是CA-MRSA的毒力因子之一，已有报道表皮葡萄球菌能够引起巨噬细胞系中一些细胞发生炎症反应[10]。有研究表明，CA-MRSA野生株与PSM-α敲除株相比，其毒力及致病性明显降低[11]。本实验从S.aureus致病的主要毒力因子入手，串联融合表达了PSM-α。纯化后的蛋白可以通过免疫动物获得特异性抗体，为预防S.aureus感染提供依据。此外，研究PSM-α对中性粒细胞的作用，可以从根本上对S.aureus的感染进行控制及治疗。

中性粒细胞是最先渗入组织中的白血球，它们通过趋化因子的梯度渐变而随血流到达感染部位，是清除细菌最重要的吞噬细胞[11]，也是天然免疫不可或缺的一部分。在炎症及败血型休克中，TNF-α、IL-1β以及IL-6是主要炎性因子，而TNF-α、IL-8是中性粒细胞强烈的化学引诱物[12]。有研究表明，PSM-α的致病机理是破坏白细胞，因此，在S.aureus逃避宿主天然免疫中PSM-α起到关键作用[6]。本研究通过PSM-α蛋白刺激人的中性粒细胞后，检测两种细胞因子的含量显示，IL-8表达量升高，提示PSM-α是通过趋化中性粒细胞从血循环到感染或组织损伤部位而引发机体的炎症反应。

本研究结果表明，PSM-α能够刺激中性粒细胞释放炎性趋化因子，致使机体发生炎症，该实验为更好的控制S.aureus的感染和提高临床治疗效果提供一定的依据。

[1]Lowy F D.Staphylococcus aureus infections[J].N Engl Med,1998,339:520-532.

[2]Koziel J,Maciag-Gudowska A,M ikolajczyk T,et al.Phagocytosis of Staphylococcus aureus by macrophages exerts cytoprotective effects manifested by the upregulation of antiapoptotic factors[J].PLoSOne,2009,4:e5210.

[3]Adcock P,Pastor P,Medley F,et al.Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in two childcare centers[J].Infect Dis,1998,178:577-580.

[4]Baggett H,Hennessy T,Leman R,et al.An outbreak of community-onset methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin infections in southwestern Alaska[J].Infect Control Hosp Epidem iol,2003,24:397-402.

[5]File T.Impact of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the hospital setting[J].Cleve Clin JMed,2007,74(Suppl 4):S6-11.

[6]Wang Rong,Braughton K R,Kretschmer D,et al.Identification of novel cytolytic peptides as key virulence determ inants for community-associated MRSA[J].Nat Med,2007,13:1510-1514.

[7]Otto M.Looking toward basic science for potential drug discovery targets against community-associated MRSA[J].Med Res Rev,2009,30:5.

[8]David M Z,Daum R S.Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus:epidemiology and clinical consequences of an emerging epidem ic[J].Clin M icrobiol Rev,2010,23:616-687.

[9]Mehlin C,Headley C M,K lebanoff S J.An inflammatory polypeptide complex from Staphylococcus epiderm idis:isolation and characterization[J].JExp Med,1999,189:907-918.

[10]Mehlin C,Headley C M,K lebanoff S J.An inflammatory polypeptide complex from Staphylococcus epiderm idis:isolation and characterization[J].Exp Med,1999,189:907-918.

[11]Voyich JM,Braughton K R,Sturdevant D E,et al.Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils[J].Immunol,2005,175:3907-3919.

[12]Mantovani A,Sica A,Sozzani S,et al.The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization[J].Trends Immunol,2004,25:677-686.