多重PCR方法鉴定牛结核分枝杆菌的研究

张喜悦 ，呼西旦，曹 瑞 ，杜鹏飞 ，努尔拜合提 ，古努尔·吐尔逊 ，孙照刚 ，范伟兴

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.新疆牧科院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000； 3.北京市胸部肿瘤结核病医院，北京 101149）

牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种人畜共患病[1]，大多数牛不呈显性感染或仅到晚期才出现临床症状，故临床诊断不易获得准确结果。目前常用的牛结核检疫方法有变态反应等免疫学方法，但在发达国家，仍然以细菌的分离和鉴定作为牛结核诊断方法的金标准[2-5]。我国在牛结核分枝杆菌的分离和鉴定上研究较少，这也成立制约我国确诊牛结核病例的关键因素。

传统的牛结核分枝杆菌鉴定方法主要包括细菌形态、染色特性和生化鉴定等，这些鉴定方法操作较为复杂且需时较长。随着结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和多种非典型分枝杆菌的序列测定完毕，很多科学家通过比较基因组学设计引物，利用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌。如Wilton等建立了可以鉴定多种分枝杆菌的分枝杆菌多重PCR[6]，Richard等建立可以区分牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌的结核分枝杆菌群（MTC）PCR方法[7]。我们在检疫出结核阳性牛并扑杀后，采集了病料进行细菌分离，然后进行多重PCR快速鉴定为牛结核分枝杆菌感染。

1 材料与方法

1.1 酶类、培养基和引物

Taq DNA聚合酶（5U/μL）、PCR Master等购自大连宝生物公司；DNA Marker 、EB（溴化乙锭）（100kb DNA ladder）等购自Promega公司。Middle brook 7H11培养基，购自美国BD公司。按照表1所示序列，PCR引物由大连宝生物公司合成。

表1 合成的引物序列

1.2 标准菌株

牛分枝杆菌标准株M.bovis（ATCC 55235）均由北京市结核病胸部肿瘤研究所细菌免疫研究实验室提供。

1.3 结核阳性牛的扑杀

利用比较变态反应和伽马干扰素试验检疫牛群，抽检在2种方法中均为阳性的牛扑杀，观察阳性牛的结核病变。

1.4 分枝杆菌的培养

无菌条件下，采集结核病变，加入适量的灭菌生理盐水，经研磨器匀浆处理后，加入2倍体积的4%硫酸，室温下处理病料15～20 min。利用生理盐水再将处理过的病料做10倍稀释，用移液器分别接种0.2 mL至Middle brook 7H11 培养基。37℃培养6周，观察结果。

1.5 分离菌株的灭活与染色鉴定

将初次培养的结核菌落再次接种到Middle brook 7H11 培养基上扩大培养。分别将扩大培养好的临床分离菌株和牛结核分枝杆菌标准株转移到密闭的含有生理盐水的试管中，将试管置于水浴锅，经80℃ 2h灭活。用分枝杆菌特异性Ziehl-Neelsen（Z-N）方法染色，于显微镜下观察结果。

1.6 分离菌株的分枝杆菌多重PCR鉴定

1.6.1 分枝杆菌多重PCR方法 以灭活的分离菌株作为样品，以牛分枝杆菌标准株作为阳性对照，用 Mycgen、 TB1 、Mycav和 Mycint 4对引物进行扩增。反应体系为20μL：样品2 μL，4对引物（Mycgen、TB1、Mycav和Mycint）的上下游引物各 1 μL，PCR Master 10 μL。反应程序为：循环 1：94℃ 10min，61℃ 2min，72℃ 3min，1个循环；循环2：94℃ 1min，61℃ 2min，72℃3min，33个循环；循环3，94℃10min，61℃ 2min，72℃ 3min，1个循环后置4℃保存。反应结束后取5μL产物进行1%琼脂糖电泳，紫外凝胶成像分析系统上观察结果。

1.6.2 分枝杆菌多重PCR判定标准 引物MYCGEN-F和MYCGEN-R扩增出1030bp片段表明为分枝杆菌种；TB1-F和TB1-R扩增出372bp片段，表明为MTC群（包括人分枝杆菌和牛分枝杆菌等）；MYCA－F和MYCA－R扩增出180bp片段，表明为禽分枝杆菌，MYCINT-F和MYCINT-R扩增出850bp片断，表明为胞内分枝杆菌。

1.7 临床分离株的MTC PCR鉴定

1.7.1 MTC PCR方法 以灭活的分离菌株作为样品，分别用16S RNA、Rv0577、IS1561、Rv1510和Rv1970 5对引物进行扩增。每对引物的反应体系为20μL：样品2 μL，每对引物的上下游引物各1 μL，PCR Master 10μL，不足部分用水补齐。反应程序为：94 ℃ 5 min初次变性，然后94℃变性1 min 、60℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 1 min，共经35个循环，最后于72℃延伸10 min结束反应，并于4℃保存反应产物。取5μL产物进行1%琼脂糖电泳，紫外凝胶成像分析系统上观察结果。

1.7.2 MTC PCR判定标准 MTC群内定型多重PCR中，对于人结核分枝杆菌，5对引物均有产物扩增，而牛结核分枝杆菌仅有16S RNA、Rv0577和IS1561 3对引物扩增，而引物Rv1510和Rv1970则无扩增。

2 结果

2.1 病理解剖结果

利用比较变态反应和伽马干扰素试验检疫牛群，抽检在2种方法中均为阳性的牛扑杀，结果发现了明显的结核病变，在肺部形成大小不等的结核结节，多数为珍珠样大小，但也有呈鸡蛋大的结节。将结节切开后，可见内有明显的干酪样坏死（图1）。

图1 充满干酪样坏死的鸡蛋大结节

2.2 细菌分离结果

将结节内的干酪样坏死取出，匀浆后经酸处理，接种于Middle brook 7H11培养基。37℃培养6周，可见有不透明的颗粒状菌落生长，表面皱褶粗糙，呈乳白色结节状，证实分离菌株生长良好。将分离菌株再次接种到Middle brook 7H11培养基上扩大培养6周。

2.3 染色鉴定结果

灭活后的临床分离菌株经分枝杆菌特异性Ziehl-Neelsen（Z-N）方法染色后，于高倍显微镜下（500倍）观察，可见有呈红色的火柴棒样细长杆菌，呈排列无序，因此可以高度怀疑其为分枝杆菌（图2）。

图2 分离菌株的Ziehl-Neelsen染色结果

2.4 分枝杆菌多重PCR鉴定结果

以灭活的分离菌株作为样品，以牛分枝杆菌标准株作为阳性对照，进行分枝杆菌多重PCR。反应结束后取5μL产物进行1%琼脂糖电泳，紫外凝胶成像分析系统上观察。结果阳性对照成立，而临床样品分离菌株同牛分枝杆菌标准株一样，引物MYCGEN-F和MYCGEN-R有1030bp片段扩增，引物TB1-F和TB1-R有372bp片段扩增。证实分离菌株属于MTC群（图3）。

图3 MTC群多重PCR鉴定结果

2.5 MTC PCR

以灭活的分离菌株作为样品，用16S RNA、Rv0577、IS1561、Rv1510和Rv1970 5对引物进行MTC群内多重PCR。扩增结束后取5μL产物进行1%琼脂糖电泳，紫外凝胶成像分析系统上观察。结果分离菌株在16S rRNA、 Rv0577和IS1561 3对引物处有扩增，片段大小依次为543bp、786bp和943bp，而 Rv1510和Rv1970 2对引物则无扩增，因此将分离菌株鉴定为牛结核分枝杆菌（图4）。

3 讨论

3.1 细菌分离的重要性

图4 临床分离株的MTC群内定型多重PCR鉴定结果

发达国家最后确诊牛结核病的最终依据仍然是细菌分离[2-5]。但由于我国没有结核阳性牛扑杀后必须进行细菌分离的规定，而且国内缺乏与牛结核相关的生物安全实验室和培养方法不科学等诸多原因，导致我国在牛结核分枝杆菌的分离和鉴定上研究较少。我们采集了临床上的牛结核结节，在我国人结核参比实验室内，用营养丰富的Middle brook 7H11培养基，最终大量培养了牛结核分枝杆菌，这也为我国能够最终确诊牛结核奠定了坚实的基础。

3.2 非特异性分枝杆菌对牛结核细菌分离的干扰

我国的很多变态反应结核阳性牛，临床上无任何临床症状，扑杀后也没有可见的病理变化，这在很大程度上是由于非特异性分枝杆菌的感染引起的[8，9]。牛场中往往存在有大量的没有致病性的非特异性分枝杆菌。如草分枝杆菌等不会引起任何动物发病；禽分枝杆菌虽然能够引起禽发病，但牛感染后并不表现任何症状，也不会传染给人，而且人类只有在缺乏免疫力如患有艾滋病等的情况下才会感染禽分枝杆菌，因此发达国家并不扑杀禽结核阳性牛[2-5]。但这些非特异分枝杆菌感染牛后，不仅干扰变态反应检疫，还会干扰牛结核细菌分离的准确性。因此临床菌株分离后，必须要并对其进行鉴定，以排除非特异性分枝杆菌的干扰。

3.3 关于MTC群内定型多重PCR

牛结核病在很多情况下也可以由人分枝杆菌引起，而且很难通过生化试验等传统方法进行鉴别。分枝杆菌的比较基因组学分析显示，不同分枝杆菌基因组的缺失区域（RD）有明显不同，如RD7区在人结核分枝杆菌中存在但在牛型分枝杆菌中则缺失，因此可以针对这些区域建立PCR方法以鉴别牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌[7]。本试验中的临床分离株的扩增结果与牛结核分枝杆菌完全一样，因此将其鉴定为牛结核分枝杆菌。

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