左卡尼汀对柔红霉素所致心肌细胞损伤的保护作用*

李雅静 王 晨

左卡尼汀对柔红霉素所致心肌细胞损伤的保护作用*

李雅静 王 晨

目的：观察左卡尼汀注射液（Levocarnitine injection）对柔红霉素（Daunorubicin，DNR）所致的心肌细胞损伤的保护作用。方法：将培养5d的新生Wister乳鼠心肌细胞随机分为正常对照组、DNR损伤组和左卡尼汀低、中、高剂量保护组，加药后继续培养24 h，测定细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）释放量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。结果：左卡尼汀各实验剂量均能显著提高受损心肌细胞的存活率，抑制LDH释放量，减少MDA的生成，提高SOD活性。结论：左卡尼汀对柔红霉素所致的心肌细胞损伤具有保护作用。

左卡尼汀注射液 柔红霉素 心肌细胞 心脏毒性

柔红霉素（daunorubicin，DNR）属于蒽环类抗癌药，适用于治疗急性粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，包括慢性急变者，但由于DNR具有剂量累积的心肌毒性，使其临床应用受到限制［1-2］。查阅相关文献，临床上常采用静脉滴注左卡尼汀对其进行预防［3-4］。左卡尼汀是脂肪酸代谢的必需辅助因子，是心肌细胞的主要能量来源，说明书中标明其适用于慢性肾衰长期血透患者因继发性肉碱缺乏产生的一系列并发症状，如心肌病、心律失常等。本实验采用体外培养新生乳鼠心肌细胞复制DNR损伤模型，观察不同剂量左卡尼汀对中毒心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 注射用盐酸柔红霉素（Pharmacia，规格：20 mg，批号：9F1004-A）、左卡尼汀注射液（常州兰陵制药有限公司，规格5 mL：1 g，批号080703）。胰酶（GIBCO）、Ⅱ型胶原酶（SIGMA）、DMEM HIGH（GIBCO）、胎牛血清（GIBCO）、MTT（SIGMA）、磷酸盐缓冲液（PBS）等。

1.1.2 实验动物 成年健康未生育SD大鼠，雌鼠体重250～280 g，共2只，雄鼠体重 280～320 g，共 3只。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（京）2007-0002。乳鼠由上述大鼠孵育（1～3日龄），每次实验用10只。

1.1.3 主要仪器 超净工作台（CLASSⅡ，TypeA/B3）、离心机（eppendorf J810R）、倒置显微镜（OLYM-PUS IX70）、恒温培养箱（HEPA class100）、酶联免疫检测仪（Synergy HT）。

1.2 方法

1.2.1 药物的配制 根据说明书中左卡尼汀的给药剂量范围，选取低、中、高三个剂量，按成人体重60kg，体表面积约为1.5 m2计算出每千克体重需给药毫克量，按1×106个心肌细胞约为1 g计算出最终细胞的低、中、高3个给药浓度，将药物溶于含10%FBS的DMEM中。

1.2.2 乳鼠心肌细胞的培养方法［5-12］1）心肌细胞的分离：将乳鼠用75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，更换手术器械，开胸，用眼科弯镊取出心脏，置于PBS中，取完心脏后，剪除心脏周边组织，并用PBS清洗以去除残留血液。用眼科剪将其剪成约1 mm3的组织碎块，加入0.08%胰酶消化约2 min，吸弃上清液，重复2～3次，向组织块中加入混合酶（0.08胰酶：0.05%Ⅱ型胶原酶=1：1），37℃孵箱消化约8 min，吸出上清液加入含血清的DMEM中以终止消化，剩余的组织块加入混合酶继续消化，根据组织块的量此过程重复3～4次，至组织块透明消失为止。用200目筛网过滤收集的细胞悬液，1 000 r/min离心8 min，收集细胞。2）心肌细胞的纯化：将培养液（DMEM HIGH+20%胎牛血清）加入离心后收集细胞的离心管中，移入培养瓶中，37℃培养1h，除去贴壁的成纤维细胞，将细胞浓度调整至5×104/mL，在细胞悬液中加入5-溴脱氧尿苷（0.1 mmol），按每孔100 μL接种到96孔培养板，每孔1 mL接种到6孔板，加入1%双抗（青霉素、链霉素）溶液。48 h换液一次，连续培养4～5 d，待心肌细胞形态及细胞搏动稳定后，可进行实验研究。3）实验分组：将培养后稳定的心肌细胞随机分为8组：Ⅰ组为空白对照、Ⅱ组DNR1 μg/mL、Ⅲ组左卡尼汀10 μg/mL、Ⅳ组左卡尼汀20 μg/mL、Ⅴ组左卡尼汀30 μg/mL、Ⅵ组DNR+左卡尼汀10μg/mL、Ⅶ组DNR+左卡尼汀20 μg/mL、Ⅷ组DNR+左卡尼汀30 μg/mL，各组6个平行孔。

1.2.3 观察指标 上述各组于给药24 h后，采用MTT法测定细胞存活率A，采用试剂盒进行乳酸脱氢酶（LHD）释放、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量测定。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 左卡尼汀对心肌细胞存活率的影响

MTT结果表明，与空白细胞组相比，随着左卡尼汀浓度的增加，存活心肌细胞数量增加，细胞存活率A上升（表1）。

表1 MTT测定结果（n=6，±s）Table 1 Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay results（n=6，±s）

表1 MTT测定结果（n=6，±s）Table 1 Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay results（n=6，±s）

No.AⅠⅢⅣⅤC（μg/mL）Blank control group levocarnitine 10 levocarnitine 20 levocarnitine 30 0.398±0.024 0.412±0.042 0.473±0.060 0.500±0.079

2.2 左卡尼汀对DNR损伤心肌细胞存活率的影响

MTT结果表明，左卡尼汀可升高DNR损伤的心肌细胞的MTT值，Ⅵ～Ⅷ组随着左卡尼汀浓度的增加，细胞存活率上升，与DNR损伤组相比有明显的差别（表2）。

2.3 左卡尼汀对DNR损伤心肌细胞LDH活性的影响

左卡尼汀能有效减少DNR损伤心肌细胞的LDH释放，Ⅵ～Ⅷ各剂量组LDH活力较DNR组明显降低，表现为良好的剂量依赖性（表2）。

2.4 左卡尼汀对DNR损伤心肌细胞MDA含量及SOD活性的影响 与空白对照组相比，DNR组心肌细胞MDA显著升高，SOD活性显著下降，Ⅵ～Ⅷ各剂量组均能使MDA含量下降及SOD活性提高（表2）。

表2 MTT 、LDH、MDA、SOD测定结果（n=6，±s）Table 2 MTT,LDH,MDA,and SOD assay results（n=6，±s）

表2 MTT 、LDH、MDA、SOD测定结果（n=6，±s）Table 2 MTT,LDH,MDA,and SOD assay results（n=6，±s）

*P＜0.05,compared with the blank control group,**P＜0.05,compared with the DNR control group

No.AⅠⅡⅥⅦⅧC（μg/mL）Blank control group DNR DNR+levocarnitine 10 DNR+levocarnitine 20 DNR+levocarnitine 30 0.398±0.024 0.315±0.012*0.321±0.061**0.366±0.006**0.390±0.006**LDH（U/L）50.5±2.6 108.7±1.7*84.3±3.5**67.2±2.7**60.7±1.9**MDA（nmol/L）2.42±1.23 8.65±1.58*6.11±0.96**4.32±0.98**3.07±0.72**SOD（U/L）35.31±4.09 17.53±3.88*20.81±2.96**29.78±1.89**30.64±2.23**

3 讨论

肿瘤药物的疗效和不良反应不仅决定于药物性质，在极大程度还决定于治疗方案，联合用药、用药剂量、药-药顺序、药-药间隔、输注速度等，均可影响治疗成败和不良反应高低。细胞毒药物所致的心脏不良反应主要表现为；可导致心肌无力、心肌缺血、低血压、高血压和心律失常，临床多是以几种心脏不良反应的混合型表现。导致心脏不良反应的主要作用机制［13-15］：细胞毒药物直接致使心肌细胞线粒体结构和功能改变，使钙稳态失衡，细胞毒药物进入心肌细胞内干扰多种代谢途径产生丙二醛，并在心肌细胞内NADPH脱氢酶作用下产生氧自由基，同时氧自由基在Fe3+的存在下，在心肌细胞中充当氧化剂，发生脂质过氧化反应，导致心肌细胞膜损伤，破坏心肌细胞膜的完整性。

为减少不良反应，临床普遍使用各种药物进行预防，然而这种联合用药的方案缺乏系统的研究。有报道左卡尼汀可预防蒽环类药物所致的心脏毒性，本实验也表明DNR对心肌细胞产生损伤作用后，细胞存活率下降，LDH释放增加，MDA含量增加，SOD活性降低。本研究预先加入左卡尼汀后，心肌细胞存活率增加，LDH的释放减少，MDA含量降低，SOD活性升高，且存在剂量依赖性，这说明左卡尼汀具有抗氧化损伤的能力，可提高自由基清除酶的活性，能保护心肌细胞的完整性。实验数据表明，左卡尼汀的加入使存活心肌细胞的数量增加，对柔红霉素所致的心肌细胞损伤具有保护作用，那么左卡尼汀是否也会使肿瘤细胞的存活率升高，从而影响化疗药物的治疗作用，还需进行体内试验作进一步的研究。

左卡尼汀作为预防用药时，其对肿瘤细胞增殖、抗肿瘤药物的疗效是否有影响，查阅国内外文献，未见研究报道。为给临床提供正确选择和使用药物的依据，减少不良反应，还需体内试验进一步研究。

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（2012-11-06收稿）

（2013-01-02修回）

Protective effect of levocarnitine on daunorubicin-induced myocardial cell injury

Yajing LI,Chen WANG
Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Key Laboratory of Cancer Prevention and Treatment of Tianjin City,Tianjin 300060,China

Chen WANG;E-mail:jieyi789@126.com

Objective:This study aimed to determine the protective effect of levocarnitine on myocardial injury caused by daunorubicin(DNR).Methods:Neonatal cardiomyocytes(aged 5 days)from trained Wister rats were randomly divided into the following groups:normal control group,low DNR injury group,and levocarnitine protection group.High-dose DNR was administered and the cardiomyocytes were cultured for 24 h.Cell viability,lactate dehydrogenase(LDH)release,superoxide dismutase(SOD)activity,and malondialdehyde(MDA)content were determined.Results:The levocarnitine dose could significantly improve the survival rate of damaged myocardial cells,inhibit LDH release,and reduce MDAproduction and SOD activity.Conclusion:Levocarnitine exhibited a protective effect on DNRiamycin-induced myocardial cell injury.

levocarnitine injection,daunorubicin,myocardial cells,cardiotoxicity

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.04.004

天津医科大学附属肿瘤医院，天津市肿瘤防治重点实验室（天津市300060）

*本文课题受2010年天津市卫生局科技基金项目（编号：2010KZ75）资助

王晨 jieyi789@126.com

This work is supported by the 2010 Science and Technology Funds of Tianjin Municipal Health Bureau(Grant No.2010KZ75)

（本文编辑：郑莉）