利用液相色谱-二极管阵列-串联质谱法结合化学计量学分析鉴别不同植物源的蜂蜜

■ 周金慧 李熠 吴黎明 陈兰珍 薛晓锋 张金振 陈芳 王鹏 黄京平 郭伟华 赵静*

（作者周金慧、李熠、吴黎明、陈兰珍、薛晓锋、张金振、陈芳、王鹏、黄京平、郭伟华、赵静单位为中国农业科学院蜜蜂研究所、农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京）、农业部蜂产品质量安全风险评估实验室）

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜和蜜露通过与自身物质混合以后，酿造而成的天然甜味物质。蜂蜜含有葡萄糖、果糖、氨基酸、酶、矿物质、黄酮、酚酸等活性组分，另外还含有小部分的花粉和蜂蜡。多酚黄酮类化合物在植物中普遍存在，按结构可分为黄酮醇、黄酮类、二氢黄酮类、异黄酮、儿茶酚、花色素和查尔酮。这些化合物具有相同的基本骨架即含有15个C原子的C6-C3-C6结构，由两个中间连有杂环吡喃或吡喃酮的苯环构成。黄酮类化合物的结构变化主要是由于羟基、氧原子和结合到环上的氢原子的数目和位置上存在差异产生的。这一类化合物能够调节植物生长和发育，并且具有多种生物学作用如抗过敏，消炎杀菌，抗癌，防血栓和扩张血管活性。在这些研究中，黄酮类化合物可以作为金属螯合剂和自由基清除剂来发挥抗氧化作用，通过抑制酶活性或螯合微量金属元素来清除羟自由基。

许多方法利用黄酮类和多酚类化合物作为特征化合物对不同植物源的蜂蜜进行指纹图谱分析，如高效液相色谱法(HPLC) ，气相色谱法，配有不同检测器的毛细管电泳法。结构上共轭双键和芳香键的存在使得黄酮类化合物在紫外区280nm和360nm有较强的吸收。电子捕获检测器(ECD)在黄酮类化合物分析中具有很好的选择性和灵敏度，其主要原理是基于对分析物在合适的电极库伦阵列检测器中发生的氧化/还原反应所产生的电流进行测定。在液相色谱-质谱联用分析中，配备有电喷雾(ESI)或大气压化学电离源(APCI)能够对待测的黄酮类化合物进行定性和定量分析，从而能够提高方法的灵敏度和特异性。基于色谱技术构建的指纹图谱是对样品进行质量控制和评价时，能够反映化学成分组成的特征性指纹轮廓。由于天然物质的基质复杂性，指纹图谱技术在分析样品的鉴别和分类方面发挥着重要的作用。化学计量学方法能够从得到的化学测量数据中最大限度地提取有用的化学信息，其最大的特点是将多变量分析方法引入到了化学研究领域。近些年来在农产品的产地和植物源分析中得到了广泛的应用。其中，主成分分析(PCA)，偏最小二乘法 (PLS)，偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和簇类独立软模式法(SIMCA)广泛应用于对模型复杂的化合物或生物学数据的建模和分析。

蜂蜜中的某些活性组分尽管含量较低但确是决定蜂蜜价格或等级的主要因素，而这些微量活性组分含量的差异是由蜜源植物决定的。市场上不同蜜源植物的蜂蜜价格不一样，这也是导致蜂蜜造假的原因之一。本研究通过分析蜂蜜中黄酮类化合物的真实含量及其范围，初步确定特征标识物，构建蜂蜜的指纹图谱并提取化学计量学信息从而鉴别荆条蜜和油菜蜜。

实验

1. 实验材料

黄酮类化合物包含芦丁(95%)、杨梅酮(96%)、槲皮素 (98%)、莰菲醇(97%)、芹菜素(95%)、松属素(95%)、苛因(97%)、高良姜素 (95%)、桑色素(95%)、阿魏酸(99%)，柚皮素(98%) 和咖啡酸苯乙酯 (97%)。黄酮类化合物购买自sigma公司(St. Louis, MO, U.S.A.)。乙腈，甲醇和甲酸为HPLC级(DIMA Technology Inc, Richmond,U.S.A.)。盐酸(37%)为分析纯试剂，购买于北京化学试剂公司。Milli-Q纯水(Bedford, MA, USA)。固相萃取(SPE)柱(Oasis HLB, 500mg/6mL)，(Milford, MA, USA)。

2. 标准溶液的制备

标准贮备液制备:分别用甲醇溶解黄酮类化合物标准品使其浓度范围为0.1～0.8 mg/mL。混合中间溶液用甲醇按1:10稀释原贮备液。基于本研究检测灵敏度和线性范围配制标准工作溶液，现用现配。标准储备液在-20℃冰箱中保存备用，混合中间溶液在2～6℃冰箱中保存。

HPLC-DAD条件：采用Agilent LC 1200系统(Agilent,Waldbronn, Germany) ，包括真空脱气机(G1322A)、二元溶剂泵(G1312B)、自动进样器(G1367D)、柱温箱(G1316B)和二极管阵列检测器(G1315C)，用来构建指纹图谱。色谱分离采用Zorbax SB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) (Agilent, Wilmington, DE)。黄酮类化合物溶液用二元梯度洗脱分离。流动相：A：纯水，B：甲醇；梯度分离程序如下：0～15 min,10～25% (B); 15～20 min, 25～30% (B); 20～30 min, 30～35% (B); 30～35 min,35～70% (B); 35～40 min,等度洗脱进一步用5 min; 40～42 min, 70～10% (B); 42～50 min, 10%(B)。柱温30℃；流速0.2 mL/min，进样量5 μL。

3. 质谱条件

安捷伦6460三重四极杆串联质谱，配有电喷雾离子源(ESI)接口和用来质谱分析和目标化合物量化的安捷伦射流离子聚焦(Agilent Technologies, Palo Alto, USA)。负离子方式检测。调节参数使目标物分析条件最优化：气体温度350℃，干燥气流速 6 L min-1，雾化器压力35 psi，毛细管电压：3500 V，鞘流气气体温度: 350 ℃，鞘流气气体流速: 9 L min-1,喷嘴电压: 1000 V。表1显示了黄酮类化合物母离子过渡到产物离子过程中采用的质谱参数。系统操作、数据获取和分析均采用MassHunter软件控制和处理。

表1. 12种黄酮类化合物的质谱参数

4. 样品制备

2009年3月和9月之间从中国不同省份采集187个蜂蜜样品，其中荆条蜜98个，油菜蜜89个。样品避光室温保存。分析前，若蜂蜜结晶，可以在恒温水浴锅不超过50℃条件下缓慢加热融化。

称取10 g 蜂蜜样品于50 mL聚丙烯离心管中，30 mL纯水混合，HCl调节pH到2，磁力搅拌器搅拌15 min至完全成为流体状。然后10,000 rpm下离心10 min，去除杂质。上清液转移到Oasis HLB固相萃取柱中上样。萃取柱提前用10 mL甲醇，10 mL纯水(HCl酸化，pH为2)活化。上样后萃取柱用10 mL纯水淋洗，吸附的黄酮类化合物用3 mL甲醇洗脱。洗脱液40℃下氮气吹干浓缩。残留物用1 mL的纯水：乙腈 (70:30)复溶。之后样品在漩涡仪混合2 min，用0.25 μm 微孔滤膜过滤，最后的溶液转移到自动进样小瓶，待HPLC-DAD-MS/MS分析。

黄酮类化合物的鉴定和分析采用安捷伦科技公司的MassHunter软件。指纹图谱和蜂蜜样品的相似性用“中药色谱指纹图谱相似度评估系统 ( 2004A 版本)”，该系统由国家食品药品监督管理局(SFDA)推荐，主要用于windows色谱相似度分析。多元分析包括PCA、PLS、PLS-DA 和SIMCA采用MATLAB 2009b软件 (The Mathworks Inc., Natick, Mass., U.S.A.)。

结果和分析

1. 色谱条件

乙腈和甲醇作为流动相广泛用于LC-MS/MS分析，因此可以通过调节流动相的比例来提高黄酮类化合物的分离度。和甲醇相比，使用乙腈作为流动相使黄酮类化合物具有更高的灵敏度和更尖锐的峰形状。而甲醇作为流动相使黄酮类化合物色谱峰中有更好的分辨率。提高水相浓度或者降低乙腈含量能够显著地提高黄酮类化合物的保留能力和分辨率。黄酮类化合物有两个紫外吸收波段：苯环结构的最大紫外吸收波长范围为260～280 nm，肉桂酰结构的最大紫外吸收波长范围为350～370 nm。所以，本研究分别在波长270 nm和360 nm处构建蜂蜜样品中黄酮类化合物的指纹图谱。

2. 质谱

根据文献报道，黄酮类化合物在正离子和负离子模式下均能够进行分析。全扫描质谱中，检测质子化的和非质子化的12个黄酮类化合物的分子离子[M+H]+和[M-H]-来比较它们的丰度。在ESI电离源正离子模式条件下，除了杨梅酮外，其它黄酮类化合物都有较高响应值(图1)。但是正离子化模式下，总离子色谱图中一些目标物容易被其它化合物干扰并且杨梅酮无响应。所以在用质谱分析黄酮类化合物时，采用负离子ESI模式以得到相对稳定和更佳的选择性和灵敏度。

3. 样品净化步骤

图1 12种黄酮类化合物在正离子和负离子模式下的总离子流图。保留时间依次为阿魏酸(18.1), 柚皮素(19.3), 芦丁(26.6),杨梅酮(28.3), 桑色素(30.6), 槲皮素(33.8), 莰菲醇(34.1), 柯茵(38.5), 松属素(39.8), 芹菜素(44.1), 高良姜素(46.4)和咖啡酸苯乙酯(46.8)。

由于蜂蜜基质中含有大量的具有不同的理化性质的黄酮类化合物，因此，很难从中将黄酮类化合物完全分离出来。用酸性水溶液溶解蜂蜜并且使其中的蛋白质变性，从而从蜂蜜样品中提取尽可能多的黄酮类化合物。沉淀下来的杂质和变性的蛋白质通过离心去除。上清液通过固相萃取柱过滤去除极性物质。在固相萃取柱洗脱实验中，纯水可以达到较好的淋洗效果，如果在纯水中增加甲醇含量则导致黄酮类化合物回收率降低和指纹图谱中色谱峰数量的减少。通过优化实验表明，10 mL纯水和3 mL甲醇即可达到较好的洗涤和洗脱效果。

（未完待续）