卵巢上皮性癌组织中DAPK基因启动子甲基化及其蛋白表达的研究

高玉霞 李红雨 班振英 张红岩 贾冬丽 姚俊阁 马学玲

卵巢上皮性癌组织中DAPK基因启动子甲基化及其蛋白表达的研究

高玉霞 李红雨 班振英 张红岩 贾冬丽 姚俊阁 马学玲

目的：研究卵巢上皮性癌组织中DAPK基因启动子甲基化及其蛋白表达在卵巢癌发生发展过程中的作用及意义。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）检测55例卵巢上皮性癌（恶性组）、25例卵巢交界性上皮性肿瘤（交界组）、30例卵巢良性上皮性肿瘤（良性组）、25例正常卵巢上皮组织（正常组）的石蜡包埋组织中DAPK基因启动子的甲基化情况。应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（S-P）法检测上述蜡块组织中DAPK蛋白的表达情况。结果：DAPK启动子在正常组、良性组、交界组、恶性组的甲基化率分别为0（0/25）、6.7%（2/30）、16.0%（4/25）、47.3%（26/55），差异有统计学意义（P＜0.001），恶性组的甲基化率高于其他三组；DAPK蛋白在正常组、良性组、交界组、恶性组的阳性表达率分别为96.0%（24/25）、90.0%（27/30）、48.0%（12/25）、30.9%（17/55），差异有统计学意义（P＜0.001），恶性组、交界组的阳性表达率均低于正常组和良性组；DAPK基因启动子甲基化和DAPK蛋白表达呈负相关。结论：DAPK基因启动子甲基化导致基因沉默、失活，引起蛋白表达下调或缺失，并参与了卵巢上皮性癌的发生发展。

卵巢上皮性癌 DAPK DNA 免疫组织化学

卵巢癌为女性生殖系统三大常见恶性肿瘤之一，死亡率居首，病因及发病机制至今尚不明确，因起病隐匿、缺乏早期诊断指标，多数确诊时已属晚期，总体5年生存率仍未超过45%［1］。卵巢上皮性癌占卵巢癌的85%～90%，研究卵巢上皮性癌发生发展的分子机制，寻找新的生物标记物和治疗靶点，改善预后仍是研究的热点。死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase gene，DAPK）是凋亡的正性调节因子，作为抑癌基因，在多种人类肿瘤中由于启动子甲基化而表达缺失［2］。国外研究报道DAPK基因启动子在卵巢上皮性癌中的甲基化率0～67%不等［3］，存在分歧，仍需进一步研究。本研究通过对卵巢上皮性癌中DAPK基因启动子甲基化及蛋白表达的检测，探讨DAPK在卵巢癌发生发展中的作用，以期为卵巢癌的诊治寻找新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2009年1月至2012年3月郑州大学第三附属医院病理科135例石蜡包埋组织，经病理证实为卵巢上皮性癌组织（恶性组）55例，卵巢交界性上皮肿瘤（交界组）25例，卵巢良性上皮性肿瘤（良性组）30例，正常卵巢上皮组织（正常组）25例。正常卵巢组织来源于因良性疾病行子宫加双附件切除术的患者。卵巢上皮性癌患者年龄为23～78岁，中位年龄为53岁，其中浆液性囊腺癌35例，黏液性囊腺癌12例，子宫内膜样癌8例。按国际妇产科联盟（FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期40例；低分化19例，中～高分化36例；淋巴结转移29例，无淋巴结转移26例；术前均未行放疗和化疗。所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，行4 μm厚连续切片用于免疫组织化学，收集10 μm厚连续切片5～10张置PE管保存以用于提取DNA。全部标本均由病理科医师再次诊断证实，标本使用符合伦理委员会认可。

1.1.2 试剂 DAPK兔抗人多克隆抗体（工作浓度1∶50）购自北京博奥森生物技术有限公司。二抗及显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。甲基化特异性试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和甲基化特异性PCR（MSP） 石蜡组织中DNA提取方法：采用酚-氯仿法提取石蜡组织中的DNA，并按照甲基化特异性PCR试剂盒说明书进行亚硫酸氢盐修饰，-20℃保存备用或直接扩增。引物设计参照文献［4］，由北京博大泰克生物技术有限公司设计合成2对引物。甲基化引物正义链为 5'-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3'，反 义链为5'-CCCTCCCAAACGCCGA-3'，扩增产物长度为98 bp；未甲基化引物正义链为5'-GGAGGATAGTTGG ATTGAGTTAATGTT-3'，反义链为 5'-CAAATCCCTC CCAAACACCAA-3'，扩增产物长度为106 bp。

1.2.2 MSP反应 反应体系：亚硫酸氢盐修饰后DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，10×PCR 缓冲液5 μL，高效DNA聚合酶1 μL，dNTPs 4 μL加3dH2O至50 μL。反应条件：94℃预变性5 min，1个循环；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸6 min。取产物5 μL于2%琼脂糖凝胶上电泳。甲基化结果判断：甲基化引物扩增出目的条带者为甲基化阳性；非甲基化引物扩增出目的条带，或甲基化引物未扩增出目的条带者为甲基化阴性。

1.2.3 DAPK蛋白表达检测方法 采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（S-P）法，具体实验步骤按试剂盒说明进行。阴性对照以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。免疫组织化学结果判定：DAPK蛋白表达于胞浆，免疫组织化学染色以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。依据细胞着色强度和阳性细胞百分率进行半定量评分［5］。着色强度：轻度着色为1分，中度着色为2分，强着色为3分。每张染色切片随机选取10个高倍视野（×400），计算10个视野的平均阳性细胞百分率。阳性细胞百分率：＜10%为1分，10%～49%为2分，50%～80%为3分，＞80%为4分。两项乘积为免疫染色的总分。总分0～1分为阴性（-），2～4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析。多组定性资料比较应用χ2检验，检验水准α=0.05，组间两两比较时应用四格表χ2检验，检验水准α'=α/比较次数，为0.008 3。两分类变量的相关性分析应用配对资料的关联性分析，P＜0.05为差异有统计学意义，关联程度使用Pearson列联系数（rp）表示。

2 结果

2.1 DAPK基因在不同卵巢组织中的甲基化情况

正常卵巢上皮组织未扩增出甲基化阳性条带，良性、交界性及恶性卵巢上皮性肿瘤组织中均可扩增出甲基化阳性条带。DAPK基因启动子在正常组、良性组、交界组、恶性组中的甲基化率分别为0（0/25）、6.7%（2/30）、16.0%（4/25）、47.3%（26/55），差异有统计学意义（χ2=38.070，P＜0.001）。恶性组和正常组、良性组、交界组分别比较差异均有统计学意义（χ2分别为17.508、14.489、7.172，P＜0.001、P＜0.001、P=0.007）。正常组和良性组、正常组和交界组、良性组和交界组比较差异均无统计学意义（χ2分别为0.350、2.446、1.222，P=0.554、P=0.118、P=0.269，表1，图1）。

2.2 DAPK蛋白在不同卵巢上皮组织中的表达情况

DAPK蛋白在正常卵巢组织和良性卵巢上皮性肿瘤组织中高表达，以（++）和（+++）为主，阳性率分别为96.0%（24/25）、90.0%（27/30），而在交界性卵巢上皮肿瘤组织及卵巢上皮性癌组织中表达下降或缺失，以（+）和（-）为主，阳性率分别为48.0%（12/25）、30.9%（17/55），差异有统计学意义（χ2=45.344，P＜0.001）。正常组和交界组、恶性组比较，良性组和交界组、恶性组比较，差异均有统计学意义（χ2分别为14.286、29.146、11.661、27.600，P＜0.001、P＜0.001、P=0.001、P＜0.001）。正常组和良性组比较，交界组和恶性组比较差异均无统计学意义（χ2分别为0.11、2.172，P=0.74、P=0.14，表2，图2）。

表1 DAPK基因启动子在不同卵巢上皮组织中的甲基化率比较Table 1 Comparison between the methylation rates of death-associated protein kinase（DAPK）promoter in different epithelial ovarian tissues

图1 DAPK基因在不同卵巢上皮组织中的甲基化情况Figure 1 Methylation of DAPK promoter in different epithelial ovarian tissues detected by methylation-specific polymerase chain reaction

表2 DAPK蛋白在不同卵巢上皮组织中的表达Table 2 Expression of DAPK protein in different epithelial ovarian tissues

2.3 卵巢上皮性癌中DAPK基因启动子甲基化及其蛋白表达的相关性分析

26例扩增出甲基化条带的卵巢上皮性癌组织中1例DAPK蛋白表达阳性，29例未扩增出甲基化条带的卵巢上皮性癌组织中13例DAPK蛋白表达阴性。DAPK基因启动子甲基化与其蛋白的表达与之间呈负相关（χ2=16.911，P＜0.001，rp=0.485，表3）。

图2 DAPK蛋白在不同卵巢组织中的表达（SP×400）Figure 2 DAPK protein expression in different epithelial ovarian tissues（SP ×400）

表3 卵巢上皮性癌组织中DAPK基因启动子甲基化及其蛋白表达的关系Table 3 Correlation between DAPK promoter methylation and its protein expression

2.4 DAPK基因启动子甲基化及其蛋白表达与卵巢上皮性癌临床病理特征的关系

DAPK基因启动子甲基化及其蛋白表达与卵巢上皮性癌的分期、病理类型、组织分化均无关（P＞0.05），DAPK基因甲基化及其蛋白表达均与淋巴结转移有关（P＜0.05，表4）。

表4 卵巢上皮性癌组织中DAPK基因甲基化及其蛋白表达与临床病理特征的关系Table 4 Correlation between DAPK promoter methylation，its protein expression，and clinicopathological features in epithelial ovarian carcinomas

表4 卵巢上皮性癌组织中DAPK基因甲基化及其蛋白表达与临床病理特征的关系（续表4）Table 4 Correlation between DAPK promoter methylation，its protein expression，and clinicopathologic features in epithelial ovarian carcinomas（continue table 4）

3 讨论

卵巢癌的发生是多步骤、多因素、多机制参与的复杂过程，其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。基因甲基化被认为是抑癌基因失活的重要机制。卵巢癌中存在多种肿瘤相关基因频繁甲基化现象，包括OPCML、GATA4、TES、TGFBI以及本研究中的DAPK［3，6］。DAPK是一种钙调蛋白调节的组氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过诱导凋亡和自噬，并抑制肿瘤细胞黏附、侵袭、迁移和转移，影响肿瘤发生发展［2］。在肿瘤形成的早期阶段，DAPK依赖p19ARF活化p53介导的凋亡检查点，阻止癌基因的活化。DAPK活化后可促进p53表达和转录能力，导致Caspase依赖的细胞死亡［7］。在肿瘤转移的多阶段过程DAPK增加肿瘤细胞对程序性细胞死亡的敏感性而抑制肿瘤转移［8］。DAPK通过抑制整联蛋白介导的细胞粘附而活化依赖p53的细胞凋亡，并能抑制细胞外基质生存信号诱导凋亡［9］。特定情况下自噬可以抑制肿瘤发生，DAPK可通过多途径多阶段调节自噬发挥肿瘤抑制作用［2，10］。

Collins等［4］研究发现DAPK基因启动子在30例卵巢癌组织样本中20例（67%）发生了甲基化，在26例卵巢癌患者的外周血样本中14例（54%）出现了甲基化，在正常个体基因组DNA样本及转化的正常卵巢上皮细胞株中均未发生甲基化。Häfner等［11］研究发现50%（16/32）卵巢癌组织标本中存在DAPK基因甲基化，56%（13/23）的卵巢癌患者血浆中存在DAPK基因甲基化。本研究发现DAPK基因启动子在卵巢上皮性癌组织样本中的甲基化率为47.3%（26/55），与上述研究结果一致。本研究还显示，DAPK基因启动子在正常组中未发生甲基化，在良性组、交界组、恶性组甲基化率逐渐升高，恶性组高于其他三组，差异有统计学意义（P＜0.008 3），提示DAPK基因启动子甲基化可能为卵巢上皮性癌发生过程中的早期事件和重要事件。

DAPK在Barrett食管腺癌、胃癌、宫颈癌等人类肿瘤中表达下调或丢失，且均与其基因启动子甲基化有关［5，12-13］。本研究发现DAPK蛋白在正常组、良性组、交界组、恶性组的表达逐渐降低，交界组和恶性组明显低于正常组和良性组，提示DAPK表达下调或丢失参与了卵巢上皮性癌由良性-交界-恶性的发展过程。进一步研究发现DAPK在卵巢上皮性癌中表达下调或丢失与其启动子的甲基化相关，与其在上述人类肿瘤中的研究结果一致，提示DAPK基因启动子甲基化可导致基因沉默、失活、蛋白表达下调或丢失，使其诱导凋亡和自噬、抑制肿瘤转移等作用减弱而促进了卵巢上皮性癌的发生发展。

本研究结果显示基因水平与蛋白水平存在不一致现象：基因水平DAPK基因启动子甲基化在交界组和恶性组有差异，但蛋白表达在交界组和恶性组间无差异，且29例未发生甲基化的卵巢上皮性癌组织中仍有13例阴性表达，原因可能是除了甲基化外DAPK还可通过组蛋白去乙酰化、基因突变、转录后调控等机制影响基因表达［14］。

DAPK基因甲基化与卵巢上皮性癌的临床分期、病理类型、组织分化均无关，与Collins等［4］研究结果一致。DAPK蛋白表达与卵巢上皮性癌的临床分期、病理类型、组织分化亦无关。DAPK基因甲基化及其蛋白表达均与淋巴结转移有关，这可能与DAPK失活后不能正常发挥抑制肿瘤转移的能力有关。淋巴结转移常关系到患者的预后。研究发现在胃癌中DAPK甲基化与其预后相关［15］，但Collins等［4］研究发现DAPK甲基化与卵巢癌患者生存无关，DAPK与卵巢癌预后的关系仍有待今后进一步研究。

本研究发现卵巢上皮性癌组织中DAPK基因启动子发生了中等程度甲基化现象，可能为DAPK表达下调或缺失的主要机制之一，并参与了卵巢癌的发生发展，且可能与卵巢癌预后有关。DAPK基因启动子甲基化为卵巢癌发生的早期事件，已研究发现卵巢癌患者的外周血中存在DAPK的同步甲基化［4］，通过检测血液中DAPK基因甲基化将可能有助于卵巢癌的早期诊断。基因甲基化具有可逆性，通过去甲基化药物恢复DAPK基因表达及其抑癌功能有望成为上皮性卵巢癌治疗的新靶点。

1 Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011：the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin,2011,61(4)：212-236.

2 Eisenberg-Lerner A,Kimchi A.The paradox of autophagy and its implication in cancer etiology and therapy[J].Apoptosis,2009,14(4)：376-391.

3 Barton CA,Hacker NF,Clark SJ,et al.DNA methylation changes in ovarian cancer：implications for early diagnosis,prognosis and treatment[J].Gynecol Oncol,2008,109(1)：129-139.

4 Collins Y,Dicioccio R,Keitz B,et al.Methylation of death-associated protein kinase in ovarian carcinomas[J].Int J Gynecol Cancer,2006,16(Suppl 1)：195-199.

5 Kuester D,Dar AA,Moskaluk CC,et al.Early involvement of death-associated protein kinase promoter hypermethylation in the carcinogenesis of Barrett's esophageal adenocarcinoma and its association with clinical progression[J].Neoplasia,2007,9(3)：236-245.

6 忽 平,李红雨,郭小芬,等.卵巢上皮性癌TGFBI基因启动子甲基化与CyclinD1蛋白表达的关系[J].中国肿瘤临床,2011,38(21)：1315-1317.

7 Raveh T,Droguett G,Horwitz MS,et al.DAP kinase activates a p19ARF?p53-mediated apoptotic checkpoint to suppress oncogenic transformation[J].Nat Cell Biol,2001,3(1)：1-7.

8 Inbal B,Cohen O,Polak-Charcon S,et al.DAP kinase links the control of apoptosis to metastasis[J].Nature,1997,390(6656)：180-184.

9 Wang WJ,Kuo JC,Yao CC,et al.DAP-kinase induces apoptosis by suppressing integrin activity and disrupting matrix survival signals[J].J Cell Biol,2002,159(1)：169-179.

10 Bialik S,Kimchi A.Lethal weapons：DAP-kinase,authophagy and cell death：DAP-kinase regulates autophagy[J].Curr Opin Cell Biol,2010,22(2)：199-205.

11 Häfner N,Diebolder H,Jansen L,et al.Hypermethylated DAPK in serum DNA of women with uterine leiomyoma is a biomarker not restricted to cancer[J].Gynecol Oncol,2011,121(1)：224-229.

12 Ye M,Li D,Zhou F,et al.Epigenetic regulation of death-associated protein kinase expression in primary gastric cancers from Chinese patients[J].Eur J Cancer Prev,2012,21(3)：241-246.

13玛依努尔·尼牙孜,刘晓婉,朱开春.维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织中死亡相关蛋白激酶启动子甲基化水平的研究[J].中华肿瘤杂志,2012,34(1)：31-34.

14 Michie AM,McCaig AM,Nakagawa R,et al.Death-associated protein kinase(DAPK)and signal transduction：regulation in cancer[J].FEBS J,2010,277(1)：74-80.

15 Sugita H,Iida S,Inokuchi M,et al.Methylation of BNIP3 and DAPK indicates lower response to chemotherapy and poor prognosis in gastric cancers[J].Oncol Rep,2011,25(2)：513-518.

（2012-09-13收稿）

（2013-02-18修回）

Methylation and protein expression of death-associated protein kinase promoter in epithelial ovarian carcinomas

Yuxia GAO,Hongyu LI,Zhenying BAN,Hongyan ZHANG,Dongli JIA,Junge YAO,Xueling MA

Hongyu LI;E-mail:tjlhylucky@yahoo.com.cn
Department of Obstetrics and Gynecology,The ThirdAffiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Objective:This study aimed to investigate the methylation and protein expression of death-associated protein kinase(DAPK)promoter in epithelial ovarian carcinoma(EOC).This study also aimed to evaluate the functions of DAPK methylation and protein expression in EOC development.Methods:Methylation-specific polymerase chain reaction was performed to detect DAPK promoter methylation in paraffin-embedded tissue specimens.The following specimens were examined:55 cases of EOC tissues(malignant group);25 borderline epithelial ovarian neoplasms(borderline group);30 cases of benign epithelial ovarian neoplasms(benign group);and 25 cases of normal epithelial ovarian tissue(normal group).Immunohistochemical streptavidin-peroxidase method was also performed to assess DAPK expression in the aforementioned specimens.Results:The rate of DAPK promoter methylation was 0%(0/25),6.7%(2/30),16.0%(4/25),and 47.3%(26/55)in normal,benign,borderline,and malignant groups,respectively.This rate was significantly higher in the malignant group than in the three groups(P＜0.008 3).The rate of DAPK-positive protein expression was 96.0%(24/25),90.0%(27/30),48.0%(12/25),and 30.9%(17/55)in normal,benign,borderline,and malignant groups,respectively.This rate was significantly lower both in malignant and borderline groups than that in benign and normal groups,respectively(P＜0.008 3).Thus,DAPK promoter methylation was negatively correlated with its protein expression.Conclusion:DAPK promoter methylation caused gene silencing and inactivity,thereby resulting in downregulation or loss of DAPK promoter protein expression,which contributed to oncogenesis and progression of EOCs.

epithelial ovarian carcinoma,DAPK,DNAmethylation,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.06.005

郑州大学第三附属医院妇产科（郑州市450052）

李红雨 tjlhylucky@yahoo.com.cn

（本文编辑：张亻 刡 ）