扶正抗癌方对H22移植瘤小鼠凋亡和端粒酶表达影响的实验研究＊

方 瑜 杨柳青 王松林 陈光伟 陕西中医学院（咸阳 712046）

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是临床上最常见的且恶性程度最高的肿瘤之一，全球发病率、死亡率逐年增长，其中有近一半的新发患者和死亡患者都在我国[1]，在恶性肿瘤中死亡率仅次于肺癌列第二位[2]。是严重威胁我国人民健康和生命的疾病。本实验欲通过建立H22腹水型瘤株移植瘤小鼠模型，观察TGF-α和端粒酶的表达，来研究扶正抗癌方抗肝癌细胞生长的可能机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 瘤株 H22腹水型肝癌瘤株，（合格证号：SCXK（军2012-008），第四军医大学实验动物中心）。

1.2 实验动物 雌性健康KM小鼠85只，1～1.5月龄，体重18～22g，（动物合格证号：SCXK（陕2011-003））。

1.3 实验用药 扶正抗癌方（FZKAF）由陕中附院制剂研究中心提供，按成人体重60kg计算，20g小鼠每公斤体重生药量折算为126g÷60kg×9.01×0.02kg＝0.378g，配置成1.89g／mL混悬液备用。对照药替加氟（生产批号：20120305，50mg／片，）研磨，按成人用量加蒸馏水配制成15mg／mL的混悬液备用。

1.4 主要试剂 一抗：兔抗小鼠TGF-α单克隆抗体（bs-0066R，0.1mL），TRT／TERT 端粒酶反转录酶抗体（bs-0233R，0.2mL）；二抗：羊抗兔多克隆抗体；DAB显色剂（C-0003）；以上试剂均购于北京博奥森生物科技有限公司；SP免疫组化试剂盒（SP-9002，北京中杉金桥生物技术有限公司）。0.1mmol／L PBS缓冲液、4%多聚甲醛（陕西中医学院中心实验室）。

2 方 法

2.1 操作方法 抽取接种7d的小鼠腹水，染色后计算活肿瘤细胞数并用生理盐水稀释成1×107／mL的瘤细胞悬液。将瘤细胞悬液按0.25mL／只在小鼠右腋皮下接种造模。取15只健康小鼠作为A：空白对照组；再将造模成功的60只，分别分为B：荷瘤对照组；C：替加氟组；D：扶正抗癌方组；E组：扶正抗癌方组＋替加氟组。A、B组：用0.9% 生理盐水灌胃；C组用15mg／mL替加氟稀释液灌胃；D组用1.89g／mL中药煎剂灌胃；以上用药量均为0.2mL／只／d，连续14d用药。E组用浓度为3.78g／mL中药煎剂0.1mL／只及浓度为30mg／mL替加氟溶液0.1mL／只在第1d、第7d共同灌胃，其他时间用D组用药方法，用药14d。小鼠于第15d脱臼处死。

2.2 计算胸腺、脾脏指数测瘤重 摘除小鼠胸腺、脾脏，称重；剥离瘤体称重，固定于10%的甲醛中。脏器指数和抑瘤率计算公式如下：脏器指数＝脏器的重量／小鼠的体重，抑瘤率＝（荷瘤组平均瘤重－实验组平均瘤重）／荷瘤组平均瘤重×100%。

2.3 免疫组化SP法测定TGF-α和端粒酶反转录酶的表达 肿瘤组织按常规病理取材，免疫组化SP法常规进行染色。TGF-α阳性反应产物位于细胞浆或（和）细胞核，为棕色颗粒样；端粒酶反转录酶TERT阳性反应产物位于细胞浆里，呈棕褐色或者棕黄色颗粒。实验结果经图像分析软件处理，每例随机观察5个视野（以每个视野下不少于100个细胞为准），用400倍光学显微镜观察，计算阳性细胞数。

2.4 统计学方法 用SPSS18.0统计分析软件进行统计分析，结果以均数±标准差（）表示，分别采用方差分析和T检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有显著性。

3 结 果

3.1 各用药组对肝癌细胞的抑制作用 见表1。

表1 各用药组对肝癌细胞的抑制作用

3.2 各组小鼠免疫功能的表达 见表2。

表2 各组小鼠免疫功能的表达

3.3 各组小鼠癌组织中TGF－α和端粒酶的表达情况见表3。

表3 各用药组荷瘤小鼠移植瘤TGF－α和端粒酶的表达

4 讨 论 TGF-α（转化生长因子α）是一小分子多肽，可诱导上皮发育，参与多种细胞转化，与EGF的氨基酸顺序相似，与其受体（EGFR）结合级联激活 MAPK信号系统（Raf-MEK-ERK），使糖酵解加速，蛋白质合成增快，EGFR的表达增多，从而导致DNA合成和细胞增殖。研究发现[3]，TGF-α低表达可以加速肝癌细胞的凋亡，其高表达则会抑制肝癌细胞凋亡，二者呈负相关性。因此，随着肝癌病程进一步加剧，血清中的 TGF-α水平则增高[4，5]。本实验显示，C、D、E 组 TGF-α蛋白的表达均降低（P＜0.05），其中E组最为明显（P＜0.01），说明各用药组可以通过抑制TGF－α的表达来抑制肝癌细胞增殖。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。在正常体细胞中几乎不表达，而在肿瘤细胞中表达量较大，可以认为端粒酶是肿瘤的特异性标志物，能作为癌症的早期诊断及肿瘤治疗的靶点，随着原发性肝癌的发展，端粒酶的表达增多[8]。本实验显示，与各用药组比较，B组小鼠端粒酶活性增高（P＜0.05），说明各用药物均可以抑制肝癌细胞中端粒酶的表达，其中以E组最为明显（P＜0.01）。通过表1和表2可以看出在抑瘤率方面C组和D组都有抗肿瘤生长的作用（P＜0.01），但对小鼠免疫功能的影响上D组对小鼠免疫功能的保护作用明显优于C组（P＜0.01）。单纯使用替加氟在消灭肿瘤细胞的同时也破坏了小鼠机体的免疫功能，但联合使用扶正抗癌方后，小鼠的免疫功能得到保护，说明联合用药具有减毒增效的作用。肝癌的发生，是人体气血虚弱，正气不足，导致阴阳气血失和，脏腑功能失调的基础上，外受邪毒侵袭，出现气滞、血瘀、湿聚、痰结等一系列病理变化，内外合邪，形成肿瘤。在形成之后，又进一步耗伤气血，日久“因癌致虚”，使正气更虚，而癌症本身“邪气”较盛，正虚不胜邪而致癌瘤在体内恶化、扩散、转移。扶正抗癌方是陕西省名中医陈光伟主任医师总结多年经验得出的方剂，以“扶正祛邪”为大纲，选取黄芪、灵芝、女贞子各15g、起到扶正作用；莪术、山豆根、藤梨根各15g等药根据不同肿瘤随证加减，祛除体内癌邪；白术、丹参、法半夏各12g健脾和血，补益后天，共助各药运化；以上药物为基础方，临证加减，在临床上取得了良好疗效。本次实验结果说明扶正抗癌方抗肝癌的机理可能与降低TGF-α和端粒酶的表达及提高小鼠免疫功能有关。

[1]Ahmedin Jemal.Global Cancer Statistics.C CANCER J CLIN 2011，61：69-90.

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