骨桥蛋白及β-连环蛋白在食管鳞癌组织中的表达及意义

王慧霞 杨梅 张铁须 陈胜枝

我国处于世界食管癌高发地带，死亡率高，目前分子生物学的发展促进了食管癌病因学的研究及靶向治疗的进展。骨桥蛋白(osteopontin.，OPN)是一种糖基化磷酸化蛋白，具有分泌性、粘附性，在人许多肿瘤中过量表达。β-连环蛋白(βcatenin)参与E-cad/cat复合体的形成，与细胞粘附有关，而且在wnt信号传导通路中与下游多个因子作用，参与细胞的增殖和分化。本研究应用免疫组化法探讨骨桥蛋白及β-连环蛋白在食管鳞癌中的表达与食管鳞癌临床分期，分化程度，转移的关系，以及骨桥蛋白及β-连环蛋白表达之间的相关性，为食管癌转移和预后提供客观生物学指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 60例标本是本院外科2009年1月至2012年7月手术切除食管癌标本(同一病例包括癌组织、距肿瘤上、下缘5 cm以外癌旁正常组织)，HE切片病理证实为鳞癌。其中男33例，女27例;年龄35～73岁，中位年龄50岁。高分化为34例、中、低分化26例，其中31例有淋巴结转移，29例无淋巴结转移。按TNM分期标准，Ⅰ+Ⅱ期29例，Ⅲ+Ⅳ期31例;按浸润深度分，T1+T225例，T3+T435例。选取60癌旁正常组织例作为对照。

1.2 试剂 浓缩型抗OPN鼠抗人单克隆抗体、β-catenin鼠抗人单克隆抗体及免疫组化试剂盒及DAB试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化(SP法) 取厚4μm石蜡切片，常规脱蜡、水化后，采用电炉加热煮沸修复抗原，OPN，β-catenin单克隆抗体均按1∶100稀释，操作参照产品说明书。工作液浓度均为1∶100，以磷酸缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。用已证实的 OPN、β-catenin染色阳性食管鳞癌切片作阳性对照。

1.3.2 免疫组化结果判定 在光镜下任意选择5个具有代表性的高倍视野，每个视野分别计数200个细胞，共计1000个细胞。骨桥蛋白:①阳性标准为:细胞质呈棕黄或棕褐色为阳性细胞。据染色程度及阳性细胞数来计算评分:a染色程度:0为阴性，1为弱阳性，2为中等阳性，3为强阳性b阳性细胞数:无阳性细胞为0，阳性细胞1% ～25%为1，阳性细胞25% ～50%为2，阳性细胞＞50%为3。a+b为3～6分者评为免疫组织染色阳性。②计数方法:结果判定在双盲法下进行，每张切片由两名病理医师分别判断。两者不一致时重新计数。

β-catenin着色于细胞膜，其染色标准参照文献，将染色强度分为3级:无着色(1级)，浅黄色(2级)，棕黄色(3级);依据镜下阳性染色细胞数占癌细胞总数的百分率综合判断，阳性细胞数≤25%为l级，26% ～75%为2级，≥75%的为3级。每张切片的最后得分为2次评分的乘积(1～9)，将1～9分为两级，＞7为阳性表达(+)，＜7为阴性表达(-)。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件包进行χ2检验及Spearman相关，以P＜0.05作为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨桥蛋白，β-catenin在食管鳞癌中的表达 60例食管鳞癌组织中，48例OPN染色阳性(80.00%)，在食管鳞癌组织中，OPN主要存在于肿瘤细胞的细胞浆中。OPN多弥散表达于癌巢中，在癌巢边缘分布较少。在60例癌旁正常组织未见OPN表达，两组间相比差异有统计学意义(P＜0.01)。βcatenin在癌旁正常组织中表达均位于细胞膜，胞浆未见明显的阳性信号。癌旁正常组织和癌组织中β-catenin阳性表达率分别为91.7%(55/60)和65%(39/60)，两组间相比差异有统计学意义(P＜0.01)

2.2 OPN及β-catenin的表达与临床病理因素的关系 骨桥蛋白的表达与淋巴结转移程度、临床分期、浸润深度有关，差异有统计学意义(χ2=4.271、7.358、15.429，P ＜ 0.05)，与肿瘤分化程度无关(χ2=2.053，P＞0.05)。β-catenin和分化程度、淋巴结转移有关，差异有统计学意义(χ2=14.204、5.350，P＜0.01)，且和临床分期有关，差异有统计学意义(χ2=5.053，P＜0.05)，分化程度越低阳性率越低，有淋巴结转移组阳性率低于无淋巴结转移组，见表1。

表1 骨桥蛋白与β-catenin与病理特征的关系

2.3 骨桥蛋白和β一catenin在食管癌中表达的相关性分析配对资料的Spearman相关分析显示，EGFR表达与β-catenin表达呈负相关关系(rs=-0.280，P=0.031)，见表2。

表2 骨桥蛋白表达及β-catenin表达的相互关系

3 讨论

食管癌预后之差在于其癌细胞有较强的增殖能力及侵袭性，遗传易感性与暴露的特定环境相互作用，多基因的遗传变异均涉及食管癌的发生和发展。

OPN含有特异的Arg-Gly-Asp序列(RGD)，通过这个序列与其生长所需的微环境-细胞外基质相结合，从而在肿瘤的进展中发挥重要的作用[1]。OPN在鳞状细胞癌的分布主要在肿瘤细胞中，肿瘤细胞中的阳性染色区出现在核周[2]，Kita Y[3]等研究OPN在食管鳞癌的阳性表达率为48%(n=175)，与淋巴结转移，淋巴管侵犯以及病理分期显著相关，并且与患者预后不良相关，但不是独立预测因子。本组实验结果表明OPN的表达与淋巴结转移程度、临床分期、浸润深度有关，差异有统计学意义(P＜0.05)，与文献报道一致，食管鳞癌中阳性表达率80%，较文献高，可能与所取样本例数过少有关。

β-catenin是多功能蛋白质，在食管癌组织中，β-catnin呈现不同程度的胞浆表达，同时伴随胞膜表达量减少或缺失，出现胞核异常表达，并与病理分化程度，静脉侵犯，淋巴结转移率相关[4]。异常表达的β-catenin破坏了E-Cad-Cat复合物的功能，使细胞黏附减弱，而过度表达的OPN的GRGDS序列与肿瘤细胞表面的整合素otvl33相互作用，激活一系列细胞内信号，使蛋白溶解酶的合成、分泌增多，溶解细胞外基质，进一步促使肿瘤浸润和转移[5]。本实验表明食管鳞癌中β-catenin和分化程度、淋巴结转移有关，OPN的异常表达和β-catenin表达之间存在负相关，二者在食管鳞癌的发展、转移中协调作用。联合检测这两种指标可能有助于食管鳞癌的病理分期及预后的判断。

[1]Chackalaparampil I，Peri A，et al.Cells in vivo and in vitro from osteopetrotic mice homozygous for c-src disruption show suppression of synthesis of osteopontin，a multifunctional extracellular matrix protein.Oncogene，1996，12(7):1457-1467.

[2]Casson AQWilson SM，McCart JA，et al.Ras mutation and expression of the ras-regulated genes osteopontin and cathepsin L in human esophageal cancer.Int J Cancer，1997，72(5):739-745.

[3]Kita Y，Natsugoe S，Okumura H，et al.Expression of osteopontin in oesophageal squamous cell carcinoma.Br JCancer，2006 Sep 4;95(5):634-638.

[4]杨小龙，李永领，龚永福.Β-catenin在食管鳞癌中的表达及意义.中国煤矿工业医学杂志，2004，7(11):1062-1064.

[5]张巧英，姚根有.骨桥蛋白与肿瘤关系的研究进展.国际遗传学杂志，2006，29(3):235-238.