头穴丛刺结合丰富环境刺激对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠突触超微结构和EGFmRNA表达的影响*

刘 波，马晓东，赵 宇，邹 伟

(黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001)

缺氧缺血性脑损伤(HIBD)是指在围产期窒息缺氧等因素导致的脑部缺氧缺血性损害，而此类疾病的治疗至今仍为世界性医学难题。本实验采用7日龄新生大鼠制备HIBD模型，给予头穴丛刺及丰富环境刺激干预，观察其对新生大鼠缺氧缺血后突触超微结构和EGFmRNA表达的的影响。为临床头穴丛刺结合环境刺激治疗缺氧缺血性脑损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

7日龄Wistar大鼠(由上海斯莱克公司提供)，雌雄不限，体重均在11～15 g之间。随机分为造模组(A)、头穴丛刺组(B)、丰富环境刺激组(C)、头穴丛刺结合丰富环境刺激组(D)。每组11只(均选取3个时间点7 d、14 d、21 d 作为观测点)。

1.2 模型制作

按照Rice法建立HIBD动物模型。7日龄新生Wistar大鼠，吸入适量无水乙醚麻醉，暴露颈部。局部碘伏消毒，做颈部正中切口，无菌分离左侧颈总动脉，并用外科0号灭菌手术丝线行双线结扎左侧颈总动脉，缝合伤口。手术结束后，将动物放回原饲养环境中恢复120 min后，置于自制的有机玻璃缺氧箱中(保持37℃水浴恒温)，持续将体积浓度为8%氧气和92%氮气的混合气体以气流量为0.5 L/min的速度输入缺氧箱中。术后出现平衡异常、不能翻身或夹尾左旋者视为造模成功，将其纳入实验。

1.3 干预方法

造模组术后另置普通母鼠笼中饲养，不予任何治疗。

头穴丛刺组大鼠采用丛刺法，按照“大鼠穴位图谱”［1］所示，取百会穴及百会左、右侧各旁开1 mm处针刺。每穴快速捻转1 min后留针2 h，每日1次。

丰富环境刺激组每日将幼鼠与母鼠分离放入EE笼［2］内，给予EE干预2 h。播放舒缓的轻音乐，并以明暗红色灯光照射。

头穴丛刺结合丰富环境刺激组予以头穴丛刺后再将幼鼠放入EE笼中给予环境刺激2 h，拔针放回母鼠笼中。

1.4 观测指标

1.4.1 透射电镜观察突触超微结构 干预结束后，各组随机抽取3只大鼠，快速断头取脑，剥离左侧海马CA1 区，组织块大小约1.5 mm ×1.5 mm ×2 mm，每例取2个标本，放入2.5%戊二醛前固定24 h，先用PBS冲洗5 min×3次，再用1%锇酸溶液固定2 h，并再次用PBS冲洗5 min×3次，梯度酒精脱水，用包埋液(苯二甲酸二丙烯酯)包埋，超薄切片做醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，而后用透射电子显微镜43 000倍观察海马CA1区神经元超微结构的变化。

1.4.2 原位杂交技术检测EGFmRNA表达 具体方法参照原位杂交技术步骤［3］。

1.5 统计学分析

用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差(±s)表示。组间差异进行方差分析，组间两两比较用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 突触超微结构变化

造模组(A)7 d海马神经细胞固缩改变，核膜皱折，染色体致密，双核仁、胞浆致密，线粒体肿胀，线粒体嵴消失，内质网扩张;14 d神经元突触数量减少，突触间隙增宽，突触囊泡减少，突触后致密物变薄;21 d线粒体减少，肿胀呈球形，部分嵴断裂或溶解消失，透明成空泡，突触界膜融合，突触小泡融合。14 d头穴丛刺组(B)、丰富环境刺激组(C)、头穴丛刺结合丰富环境刺激组(D)均神经水肿严重，突触融合，线粒体水肿较造模组减轻;21 d头穴丛刺组(B)、丰富环境刺激组(C)突触小泡多，致密物质较丰富，突触界限模糊。随着治疗时间的增加，21 d头穴丛刺结合丰富环境刺激组(D)海马神经元核膜完整光滑，胞浆粗面内质网、核糖体及高尔基体、线粒体等细胞器完整、丰富;核内染色质均匀，突触结构好，突触小泡数量较多。见图1～8。

图1 14天A组 图2 21天A组 图3 14天B组

图4 21天B组 图5 14天C组 图6 21天C组

图7 14天D组 图8 21天D组

2.2EGFmRNA 表达

7 d各组EGF2mRNA阳性表达无统计学意义(P＞0.05);14 d、21 d头穴丛刺结合丰富环境刺激组(D)EGF2mRNA阳性表达最多，与造模组、头穴丛刺组、丰富环境刺激组比较具有显著性差异(P＜0.01)。见表1。

表1 EGF2mRNA阳性细胞表达结果(±s)

注:与造模组比较，aP＜0.01;与头穴丛刺组比较，bP＜0.01;与丰富环境刺激组比较，cP＜0.01。

组别 n 7 d 14 d 21 d A 8 15.34 ±2.15 9.63 ±2.21 5.21 ±0.69 B 8 16.46 ±2.23 12.53 ±2.86a 10.16 ±2.36a C 8 15.27 ±2.12 11.43 ±3.37a 9.21 ±2.13a D 8 16.87 ±3.25 15.58 ±4.35abc 13.45 ±3.57abc

3 讨论

中枢神经系统是神经元之间以错综复杂的突起及突触相联系形成的神经网络。神经元又称为神经细胞，是构成神经系统结构和功能的基本单位，是大脑学习记忆的结构基础。而突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。突触是由突触前膜、突触间隙和突触后膜三部分构成。通常情况下，突触多处于休眠状态，在外界条件的刺激下，突触可被激活，使损伤造成的功能障碍得到恢复［4］。

李文霞等制备HIBD新生大鼠模型，采用电刺激小脑顶核，观察其对神经元超微结构的影响，发现缺氧缺血组线粒体肿胀，有的空泡化，神经元细胞水肿，粗面内质网脱颗粒，突触间隙融合消失等结构改变;而电刺激组线粒体数量增加，细胞器丰富，突触间隙清晰，突触小泡增加。说明电刺激可减轻脑缺血神经元及突触的病理损伤，促进HIBD脑组织超微结构的恢复［5］。而于若谷等发现，早期给予抚触及丰富环境刺激干预，可以促进缺血缺氧的脑组织超微结构恢复［6］。本研究观察头穴丛刺结合丰富环境刺激能够明显促进缺氧缺血脑损伤后突触超微结构的恢复，优于单纯头穴丛刺和丰富环境刺激。

表皮生长因子(EGF)作为一种促神经生长因子，参与了中枢神经系统组织和细胞的生长、增殖及分化［7］，可促进神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞。杨卓欣等［8］电针任脉承浆、气海、关元三穴，观察对缺血再灌注大鼠脑内生长因子的表达影响，结果发现EGFmRNA、NGFmRNA、bFGFmRNA的阳性表达均随着再灌注时间的延长，呈现减弱的趋势，而电针任脉经穴能够明显延迟这一趋势的发展，并促进MCAO大鼠脑内EGFmRNA等的表达，从而达到抗缺血损伤、神经修复的作用。本实验结果显示，14 d、21 d头穴丛刺、丰富环境刺激均可促进EGFmRNA表达，与造模组比较有显著性差异，而头穴丛刺结合丰富环境刺激的EGFmRNA阳性表达明显多于单纯头穴丛刺和丰富环境刺激组。

综上所述，头穴丛刺结合丰富环境能够明显促进缺氧缺血脑损伤后突触超微结构的恢复和增加EGFmRNA的表达，这为临床应用头穴丛刺结合环境刺激治疗缺氧缺血性脑损伤提供了实验依据。

［1］华兴邦.大鼠穴位图谱的研制［J］.实验动物与动物实验，1991(1):1－5

［2］Rosenberg AA，Muydaugh E.The effect of blood glucogse consentration on postasphyxia cerebal hemodynamics in newborn lambs［J］.Pediatr Res，1990，27:454

［3］马晓明，杨卓欣，于海波，等.电针任脉经穴对MCAO大鼠脑内表皮生长因子表达的影响［J］.中华中医药学刊，2011，29(7):1602－1605

［4］戴红.神经系统的可塑性与运动再学习［J］.现代康复，1998，2(8):786－787

［5］李文霞，曹娟，代红，等.电刺激小脑顶核对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠神经元超微结构的影响［J］.实用儿科临床杂志，2009，24(2):140－142

［6］于若谷，赵聪敏，王丽雁，等.丰富环境干预后HIBD大鼠脑超微结构改变［J］.第三军医大学学报，2006，28(8):819 －820

［7］He X，Hart D.Progress onmechanisms ofneurological rehabilitation treatment following stroke［J］.Zhongguo Linchuang kangfu，2003，7(19):2722－2723

［8］杨卓欣，马晓明，于海波，等.缺血再灌注大鼠脑内生长因子的表达及电针任脉的干预作用［J］.中华中医药学刊，2009，27(6):1152－1155