九头芥梅干菜提取物的抗氧化性能研究

王 超 汪江英 时 磊 黄师荣

（湘潭大学化工学院，湖南 湘潭 411105）

油脂和含油脂食品易于发生氧化反应，导致营养价值和感官品质的下降，甚至变质［1］。另一方面，很多心血管疾病以及衰老的发生和发展也与氧化反应有关［2］。因此开发和利用抗氧化活性的物质对食品和人体均具有相当重要的作用。抗氧化剂可以通过抑制氧化链反应的引发或传递来延缓或抑制脂类或其他分子氧化，阻止或修复氧化对身体细胞的损伤。近年来，合成抗氧化剂如BHA、BHT、TBHQ等由于其毒性而受到质疑。大量研究［3－5］表明，植物中的许多物质，尤其是多酚类物质，具有很强的抗氧化作用，可以抑制自由基反应的传递、防止人体生病、延缓脂类氧化酸败。因而从植物材料中寻找天然抗氧化物质越来越受到人们的欢迎，对植物提取物有效成分抗氧化活性的研究和开发日益受到重视。

梅干莱亦称梅菜，是把三月青、九头芥、雪里蕻等鲜菜堆黄后腌制再干燥而制得的［6］。梅干菜是一种极耐贮存的菜，在室内常温下，2～3年都不会变质。在中国民间梅干菜经常被用于蒸肉，据报道［7］，梅干菜蒸肉比不加梅干菜的蒸肉能保存更久，其保质期可达6个月之久。梅干菜这一性能可能要部分归因于其潜在的抗氧化性。

王萍等［8］报道了叶用芥菜具有较强的抗氧化活性。Fang等［9］研究了腌制方法对雪里蕻中总游离酚酸含量、总酚酸含量、总酚含量和抗氧化活性的影响。他们发现，在腌制过程中总游离酚酸含量增加，腌制是保持雪里蕻酚酸和抗氧化物质的较好方法，雪里蕻腌菜是抗氧化物质的良好来源。但是，关于九头芥梅干菜的抗氧化性研究还鲜有报道。本试验以酚类化合物含量及抗氧化活性为指标，研究九头芥梅干菜中酚类化合物的提取、富集及其抗氧化活性，旨在为九头芥梅干菜的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

九头芥梅干菜：购于江西广昌农村市场，是用九头芥鲜菜进行堆黄后腌制，再在日光下暴晒至菜梗晒干而得；

DPPH：日本和光纯药工业株式会社；

福林酚、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素：合肥博美生物科技有限公司；

甲醇：色谱纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；

其余试剂：均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

紫外分光光度计：2802SW型，龙尼柯（上海）仪器有限公司；

高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司；

电子天平：BSA2245型，赛多利斯（北京）科学仪器有限公司；

旋转蒸发器：R－201型，上海申生科技有限公司；

液相色谱仪：Waters 1525型，美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 九头芥梅干菜乙醇提取物的制备 称取经干燥粉碎的九头芥梅干菜粉末20g，按料液比1∶5（m∶V）加入无水乙醇，60℃恒温水浴振荡浸提4h，抽滤，滤渣按上述条件重复提取1次，抽滤后合并两次滤液并于40℃下减压旋蒸至干，得到3.466g褐色的梅干菜乙醇提取物。

1.3.2 九头芥梅干菜乙醇提取物的分级萃取 按文献［10］的方法进行。称取10g九头芥梅干菜乙醇提取物，加入100mL蒸馏水，并用超声辅助分散，所得悬浮液依次采用石油醚、乙酸乙酯各100mL分别萃取3次，得到石油醚、乙酸乙酯萃取液和萃余液。各萃取液和萃余液分别在40℃减压旋蒸至干，得到石油醚相1.712g，乙酸乙酯相2.289g，萃余相5.413g。

1.3.3 总酚含量测定 参照文献［11］，并加以改进。把九头芥梅干菜乙醇提取物及其石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和萃余物用无水乙醇配成质量浓度为2mg／mL的溶液。取1mL测试液加入25mL容量瓶中，接着加入2.5mL用蒸馏水稀释了10倍的福林酚试剂和2mL质量浓度为75g／L的Na2CO3，再加蒸馏水定容至刻度，混合均匀后把试管置于50℃的水浴中保温5min，取出并冷却，所得溶液于760nm处测吸光度。以无水乙醇做空白对照。

标准曲线的建立：以没食子酸为标准品，分别配成0.02，0.03，0.04，0.05，0.06mg／mL标准液，按以上方法制作标准曲线。样品中的总酚以相当于没食子酸的含量表示，单位以每g提取物含有没食子酸的当量mg数表示（mg GAE／g）。

1.3.4 DPPH自由基清除活性测定 按文献［12］的方法进行。取不同质量浓度的各个组分乙醇溶液3mL，与3mL浓度为200μM的DPPH乙醇溶液混合，使其终浓度为100μM，振荡摇匀，置于暗处反应30min后于517nm处测吸光度。每个质量浓度平行测定3次，取平均值。同时以BHT作为阳性对照。用下式计算DPPH自由基的清除率：

式中：

S——DPPH自由基的清除率，%；

A0——空白样品的吸光度；

As0——测试样品的本底吸光度；

As——测试样品的吸光度。

1.3.5 还原力测定 按文献［13］报道的方法进行。取1mL不同质量浓度的各个组分的乙醇溶液，加入2.5mL磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 6.6）和2.5mL 铁 氰化钾 （1%，m／V）。混合物于50℃下保温20min，然后加入2.5mL，10%的三氯乙酸，激烈振摇后，3 000r／min离心10min。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL三氯化铁溶液（0.1%，m／V）。 摇匀，静置30min后，于700nm处测吸光度，空白组以无水乙醇代替样液。吸光度增加表明还原力增加。同时用BHT做阳性对照。

1.3.6 高效液相色谱分析 各样品用色谱级无水甲醇配成5mg／mL的样液，标准品配制成0.1mg／mL的标准品样液，各样品在进样前用孔径为0.45μm的膜过滤器进行了过滤。所用的色谱柱为Symmetry?C18 5μm 4.6×250nm柱。色谱条件［9］：流动相A为甲醇，流动相B为4%的乙酸，采用等度洗脱A∶B＝20∶80（V∶V），流速为1mL／min，洗脱时间为35min，柱温为40℃，进样量为10μL，检测波长为260nm。通过比较各样品和标准品的保留时间对一些峰进行了鉴定。

1.3.7 统计分析 试验数据用平均值 ± 标准差表示，采用SPSS统计软件包进行分析，显著性检验（P＜0.05）以Duncans检验方法进行。

2 结果与分析

2.1 总酚含量

酚类化合物是苯环上带有羟基官能团的一类物质。许多研究［14，15］表明，酚类化合物对天然植物提取物的抗氧化活性有重要贡献。因此，测定提取物中的总酚含量显得十分的重要。在本研究中用Folin－Ciocalteu比色法测定了九头芥梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分中的总酚含量。

图1 九头芥梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分的总酚含量Figure 1 Total phenolic contents of ethanolic extract from pickled and dried mustard and its various fractions

本试验以没食子酸为标准品，得到的回归方程为y＝6.493 3x＋0.048 3，相关系数R2＝0.996 7。 试验结果表示为没食子酸当量／提取物（mg GAE／g）。由试验测得各样品的总酚含量见图1。由图1可知，各萃取相中总酚含量差异显著，乙酸乙酯相中总酚含量为17.57mg GAE／g，分别是乙醇提取物、石油醚相和萃余相的3.2倍、2.8倍和3.8倍，各样品中总酚含量大小依次是乙酸乙酯相＞石油醚相＞乙醇提取物＞萃余相。结果表明，主要的酚类物质经过萃取都溶入了中等极性的乙酸乙酯中，根据极性相似相容原理可知九头芥梅干菜含有的酚类物质以中等极性的酚类化合物为主。

2.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈现深紫色，在517nm处有最大吸收。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，其一个N原子上的孤电子对被配对，溶液的吸光度会减弱或消失。通过DPPH溶液吸光度的改变来评价清除自由基的能力大小，吸光度减少得越多表明其清除能力越强。

图2给出了九头芥梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分对DPPH自由基的清除活性。由图2可知，各样品对DPPH自由基都有很好的清除率，随着浓度的增加对自由基的清除率显著增加。乙酸乙酯相在浓度为2mg／mL时，对DPPH自由基的清除率高达96.10%。通过origin程序拟合计算得出BHT、乙醇提取物、石油醚相、乙酸乙酯相和萃余相对DPPH自由基清除活性的EC50（清除活性为50%时的样品浓度）分别为0.07，2.20，3.06，0.65，3.92mg／mL。各试样对DPPH自由基清除力的大小依次为BHT＞乙酸乙酯相＞乙醇提取物＞石油醚相＞萃余相。在九头芥梅干菜乙醇提取物的各溶剂萃取组分中，乙酸乙酯相清除活性最强，表明在九头芥梅干菜中对DPPH自由基清除活性最强的化合物为中等极性物质。许多研究得到了相似的结果［16－20］。

比较各样品对DPPH自由基清除率的大小顺序与其总酚含量的大小顺序，发现它们之间的关系并不一致，这可能与不同样品中有效酚酸的种类和含量不同有关，进而对DPPH自由基清除能力不同，也有可能与其含有的非酚类化合物相关。

图2 梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分对DPPH自由基的清除活性Figure 2 DPPH radical－scavenging activities of ethanolic extract from pickled and dried mustard and its various fractions

2.3 还原力

还原能力是物质抗氧化能力的一个重要指标，也是物质抗氧化机理之一。许多研究［18，20，21］表明，植物提取物的抗氧化活性与其还原力存在对应关系。还原力测定原理是基于Fe3＋被抗氧化物质还原为Fe2＋而呈现绿色，并于700nm处有最大吸收。根据吸光度的大小来判断试样抗氧化活性的强弱。反应体系的吸光度增加意味着还原力增加。

图3给出了九头芥梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分和BHT的还原力。由图3可知，所有样品的还原力均随着浓度的增加而增加，所有浓度下各样品均显示出一定程度的还原能力。在浓度为5mg／mL时，九头芥梅干菜乙醇提取物、乙酸乙酯相、石油醚相和萃余相的吸光度分别为0.314，0.764，0.648，0.288。各样品的还原力大小顺序为 BHT＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞乙醇提取物＞萃余相。许多文献均得到相似的结果［17－20，22］，即乙酸乙酯组分的还原力明显强于其余组分，表明乙酸乙酯组分更易供出电子还原Fe3＋。

许 多研究［14，15，22，23］表 明 酚 类 化 合 物 的 含 量 与 抗 氧 化 性密切相关：酚类含量越高其抗氧化性越强。由各样品的还原力大小顺序可以看出，其与各样品总酚含量的大小顺序相一致，说明酚类化合物对各样品的还原力贡献较大。

图3 梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分的还原力Figure 3 Reducing power of ethanolic extract from pickled and dried mustard and its various fractions

2.4 高效液相色谱分析

九头芥梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分的HPLC分析表明其中存在酚类化合物。由图4可知，各样品的HPLC峰数量、保留时间、响应值存在一定差异。乙酸乙酯相的峰数量最多，石油醚相的峰数量最少，萃余相的峰响应值很高，而石油醚相的峰响应值很低，说明各样品中抗氧化物质的组成和含量不同。在所用的几种标准品保留时间的基础上鉴定了一些峰，发现九头芥梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分中均含有没食子酸，而且为主要成分，其峰面积大小顺序为萃余相＞乙醇提取物＞乙酸乙酯相＞石油醚相。

图4 梅干菜乙醇提取物及其各溶剂萃取组分的高效液相色谱图Figure 4 HPLC chromatograms of ethanolic extract from pickled and dried mustard and its various fractions

3 结论

九头芥梅干菜乙醇提取物及其石油醚和乙酸乙酯萃取组分均具有一定的抗氧化性，它们的总酚含量、抗氧化活性差异显著，其中乙酸乙酯萃取的组分抗氧化活性最强，总酚含量也最高；表明可以用乙酸乙酯来富集九头芥梅干菜中的抗氧化成分。高效液相色谱分析表明九头芥梅干菜乙醇提取物及其石油醚、乙酸乙酯萃取物和萃余相中主要的酚类化合物为没食子酸。试验结果表明九头芥梅干菜提取物可以作为天然抗氧化剂的潜在来源。

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