大鼠妊娠前后吸入七氟烷对仔鼠海马NMDA受体表达的影响

王宇恒，成永霞，艾春雨，孙晓峰，焦晶华，赵宏，王俊科

(1.沈阳医学院奉天医院麻醉科，辽宁 沈阳 110024;2.牡丹江医学院病理学教研室;3.中国医科大学附属第一医院麻醉科)

随着儿科和产科手术的发展，手术的复杂程度和持续时间都日益增加，吸入全麻药被越来越多的应用于产科和儿科的镇静和麻醉。但是近来的研究却证实，这些药物对处于特殊发育期的动物大脑有神经毒性作用，且这种毒性作用可引起致青春期和成年期的行为学改变。为降低麻醉风险，探讨吸入麻醉药对发育期神经系统的影响很有必要，且对长期暴露于吸入麻醉药的孕期的手术室工作人员亦具有一定的意义。N－甲基－D－天冬氨酸受体 (N－methyl－D－asparate receptor，NMDAR)是皮层、海马等脑区广泛存在的与学习和记忆密切相关的一种受体，在人脑发育期神经元网络的建立中发挥了重要的作用［1］。有研究结果提示高位中枢的NMDAR参与了七氟烷镇痛作用的调制过程。本研究观察大鼠妊娠前后吸入2.4%七氟烷对仔鼠海马NMDAR的影响，旨在说明妊娠前后吸入七氟烷是否会影响实验动物神经元凋亡和神经系统生长发育，从而产生远期可塑性的变化，进而影响智力发育和行为学变化。

1 材料与方法

1.1动物及分组 雌性SD大鼠3月龄，体重250～300 g，雄性SD大鼠体重450～500 g(中国医科大学实验动物中心提供)，实验药物七氟烷为美国百特国际 (Baxter)有限公司生产 (批号S062G761)。雌性SD大鼠随机分为3组：对照组(C组)，妊娠前吸入七氟烷组 (BS组)，妊娠期吸入七氟烷组 (PS组)。

1.2 动物分组后处理 C组、PS组自由进食水，各组雌鼠分别以雌雄2∶1比例与雄鼠合笼过夜。BS组于妊娠前吸入2.4%七氟烷6 h，于100%纯氧中复苏后，于当晚以雌雄2∶1比例与雄鼠合笼过夜。各组雌鼠于次日清晨8时检查阴道涂片，以涂片查到精子定为妊娠0天。确定为怀孕的雌鼠单独分笼喂养。孕鼠分娩后，保持每只雌鼠至少哺育8只仔鼠。PS组在确定妊娠后，于妊娠6、10、14和18 d分别吸入2.4%七氟烷，左心室穿刺取动脉血0.3 ml做血气分析。免疫荧光和RT－PCR检测各组仔鼠出生当天(T1)、出生后第7天 (T2)、出生后第14天 (T3)、出生后第28天 (T4)海马NMDAR(NR1、NR2A、NR2B)的表达，从每只母鼠哺育的仔鼠中随机抽取2只仔鼠，使每组包含12只仔鼠。

1.3 仔鼠海马中NMDAR的免疫荧光检测 1∶100稀释的兔抗大鼠各指标的IgG抗体NR1抗体、NR2A抗体、NR2B抗体 (武汉博士德公司产品)，滴加试剂盒中提供的羊抗兔FITC荧光二抗，室温下孵育，封片，避光保存。在荧光显微镜 (IX71 Model，OLYMPUS，日本)下观察各指标免疫荧光结果，使用图像采集系统 (BX41 Model，OLYMPUS，日本)，采集各指标免疫荧光图像。显微图像 分 析 系 统 (MetaMorph/C－5050/BX40model，UIC，USA;OLYMPUS，日本)，检测各指标积分光密度值 (IOD值)。

1.4 仔鼠海马中NMDAR的RT－PCR检测 引物序列设计 (上海生工生物工程技术服务有限公司)：NR1 F：5'－TCGCATCATCTCAAACCAGAC－3'R：5－CTCATCT CTAGCCAGGTCTA－3';NR2A F：5'－TTGTTCCCCAAGAGTTTGCTT－3'R：5'－ACTCCACACTGCCCATGAAC－3';NR2B F：5'－TCCAGTTCCTGCAGGGAGTT－3'R：5'－GTTTGATGAAATCGAGCTGGC－3'。两步法 RT－PCR：依据 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒 (大连宝生物公司产品)提供说明书进行操作KODAKID型凝胶成像，凝胶成像获取的图片用 Image Lab软件进行分析，以 NR1、NR2A和NR2B的灰度值与GAPDH灰度值的比值反映NR1 mRNA，NR2A mRNA和NR2B mRNA的表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件，正态分布计量资料以 (±s)表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

各组随机血气分析各项指标均在正常范围内，且组间比较差异无显著性，见表1。

表1 3组仔鼠血气分析值比较 (n=6，±s)

表1 3组仔鼠血气分析值比较 (n=6，±s)

组别pHPaCO2(mmHg)PaO2(mmHg)HCO－3(mmol/L)SaO2(%)T(℃)C组 7.45±0.05 35.7±2.9 94.0±9.2 24.5±3.5 96.0±3.0 37.0±0.3 BS组 7.40±0.07 39.7±7.0 87.0±6.0 28.2±4.0 95.0±3.1 37.1±0.4 PS组 7.38±0.04 38.5±2.9 89.0±7.0 26.0±3.4 94.0±2.0 36.9±0.3

免疫荧光结果提示：与C组相比，BS组仔鼠海马NMDAR表达差异无显著性 (P＞0.05);PS组仔鼠T1～T3时NR1和NR2A的表达明显增强(P＜0.01)，NR2B表达显著降低 (P＜0.01);T4时NMDAR表达差异无显著性，见表2。

表2 3组仔鼠海马NR1、NR2A及NR2B表达的比较 (n=12，±s)

表2 3组仔鼠海马NR1、NR2A及NR2B表达的比较 (n=12，±s)

注：与C组比较，1)P＜0.01

组别NR1 NR2A NR2B T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 C组 40.8±2.8 42.4±1.8 43.5±2.4 44.2±2.2 49.3±4.2 53.9±1.3 53.8±1.7 54.2±2.1 30.0±3.1 31.2±1.9 30.6±2.9 33.4±2.3 BS组 41.50±2.943.9±2.2 44.3±2.7 43.9±2.2 51.5±3.0 55.3±2.0 55.1±3.9 53.9±2.1 31.4±2.9 30.0±2.3 31.1±2.0 32.7±1.9 PS组 49.4±2.51)49.0±2.01)51.1±1.91)42.8±2.3 61.0±2.71)61.5±2.41)61.1±2.01)53.0±2.2 27.4±1.71)27.8±1.41)28.9±2.71)31.8±3.8

RT－PCR结果显示：与C组相比，BS组仔鼠海马NMDAR mRNA表达差异无显著性 (P＞0.05);PS组仔鼠T1～T3时NR1 mRNA和NR2A mRNA表达增强 (P＜0.01)，NR2B mRNA表达降低 (P＜0.01)，T4时NMDAR mRNA表达差异无显著性，见表3。

表3 3组仔鼠海马NR1 mRNA、NR2A mRNA、NR2B mRNA表达的比较 (n=12，±s)

表3 3组仔鼠海马NR1 mRNA、NR2A mRNA、NR2B mRNA表达的比较 (n=12，±s)

注：与C组比较，1)P＜0.01

组别NR1 mRNA NR2A mRNA NR2B mRNA T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 C组 0.863±0.031 0.714±0.024 0.702±0.014 0.678±0.029 0.790±0.026 0.801±0.052 0.744±0.050 0.753±0.074 1.159±0.061 1.130±0.040 1.064±0.019 1.104±0.033 BS组 0.829±0.044 0.707±0.022 0.734±0.023 0.672±0.018 0.766±0.038 0.764±0.044 0.772±0.052 0.741±0.070 1.123±0.085 1.103±0.044 1.049±0.051 1.069±0.064 PS组 0.944±0.0461)0.887±0.0821)0.892±0.0431) 0.653±0.027 0.928±0.0621)0.904±0.0411)0.951±0.0241) 0.712±0.049 0.921±0.0541)0.776±0.0871)0.818±0.0441)1.113±0.021

3 讨论

具有发育毒性的外来化合物与发育中的胚胎或胎仔接触，可因胚胎或胎仔所处的发育阶段不同而呈现不同的敏感性。在胚胎发育后期和新生儿期，最容易表现的发育毒性是生长迟缓和神经、内分泌以及免疫系统机能的改变。在常用实验动物中，自受精日计算，大鼠器官发生期约为9～17 d，大鼠着床前胚泡形成期，自受精日计算，约为3～4 d，开始着床日约为5.5～6 d。本实验使用的出生0、7、14、28 d的仔鼠相当于新生儿期、儿童期和青年期。本实验将母体大鼠于妊娠前或妊娠6、10、14、18 d吸入1.6%的异氟烷或2.4%七氟烷，经血气分析结果证实，排除了由于其它原因如缺氧，酸中毒等导致的仔鼠脑发育异常，成功建立了大鼠吸入麻醉药模型。

吸入麻醉药以一种可逆的和剂量依赖性的方式抑制NMDAR。NMDAR在学习记忆、神经发育、神经系统疾病中起着重要的作用［2－3］。未成熟大脑的快速发育期即突触形成期，NMDAR被短暂阻滞后，多个重要脑区神经元凋亡增加。出生前后NMDAR亚基表达的进行性变化对发育期突触塑型起到了重要作用。氯胺酮可引起前脑皮层区神经元凋亡发生增加，并伴随着NR1表达上调和NR1 mRNA表达的增加［4－6］。新生大鼠注射NMDAR拮抗剂后，大鼠皮质、海马及齿状回 NR2A受体都有所增加［7］。Tang［8］发现NR2B高表达的转基因小鼠具有超常的学习与记忆能力，在多种行为学测试中表现出良好的学习记忆成绩，从而提出NR2B与大脑的认知密切相关，并将NR2B命名为“聪明基因”，提出该基因就是记忆基因的论断。

本实验结果表明，母体妊娠6、10、14、18 d吸入2.4%七氟烷6 h，可使仔鼠0、7、14 d海马NR1、NR2A和NR1 mRNA、NR2A mRNA表达增多，NR2B和NR2B mRNA的表达下降，而这种变化于仔鼠出生后28 d消失，提示大鼠于妊娠特定时间吸入七氟烷6 h可能会引起仔鼠出生后短期内海马神经元凋亡增加和神经系统发育异常，并且可能会影响到仔鼠短期内的认知功能，而这种影响在仔鼠出生后28 d消失。母体妊娠期吸入麻醉药引起的子代神经系统发育的形态学和行为学改变有待进一步研究。

产科和儿科以镇静麻醉为目的的使用NMDAR拮抗剂会引起相应的影响，但其影响是在从婴儿到成年的各个时期内逐渐表现出来［9］。七氟烷临床剂量的使用能否导致未成熟大脑神经元的损伤，这种损伤在患者的生命中何时表现，如何表现都未得到证实，继续深入的进行这一研究将会对产科和儿科麻醉有重要的意义。

［1］Takai H，Katayama K，Uetsuka K，et al.Distribution of N－methyl－D－aspartate receptors(NMDARs)in the developing rat brain ［J］.Exp Mol Pathol，2003，75(1)：89 －94.

［2］Kumar A，Zou L，Yuan X，et al.N－methyl－D·aspartate receptors：trailsient of NRI/NR2A/NR2B subunits"after traumatic brain injury inarodentmodel［J］.J Neurosci Res，2002，67(6)：781－786.

［3］Onur OA，Schlaepfer TE.Kukolja J，et al.The N－methyl－D－aspartate receptor co－agonist D－eycloserine facilitates declarative learning and hippocampal activity in humans ［J］.Biol Psychiatry，2010，67(12)：1205 －1211.

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［8］Tang YP.Shimizu E，Dube GR et al.Genetic enhancement of learning and memory in mice［J］.Nature，1999，401(6748)：63－9

［9］范文辉，陈康宁.神经干细胞疗法［J］.现代康复，2001，5(11)：70－71.