慢性乙型肝炎肝脏炎症分期与血清多肽分子的相关性分析*

徐铭益 贾小芳 张启迪 李郑红 张清清 王兴鹏 张丽军 陆伦根#

上海交通大学附属第一人民医院消化内科1(200080) 复旦大学附属公共卫生中心蛋白组学平台2

我国是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高流行区，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性率为9.09%［1］，现症慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者超过3000万，每年新发患者100余万例，且发病日趋低龄化。据统计，CHB患者肝硬化失代偿的年发生率约为3%，5年累计发生率约为16%［2］。肝组织炎症活动度是评价CHB病变的重要指标。准确评估肝组织炎症程度对CHB的治疗、药物疗效的评估以及预后干预均具有重要临床意义。及时评估和动态观察肝组织病变程度的演变，亦是防治CHB发展为肝硬化和终末期肝病的关键。新技术多肽组学已应用于筛查新的诊断标记物，包括循环多肽筛检多种疾病的诊断标记物［3，4］。本研究通过采用血清多肽组学法，旨在筛选新的CHB非创伤性诊断炎症分期的标记物。

对象与方法

一、主要试剂和仪器

1.主要试剂:N，N－甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺购自美国USB公司;碘乙酰胺(IAA)购自美国Amresco公司;色谱纯乙腈、甲醇(MeOH)购自美国Merck公司;甲酸购自美国Fluka公司;十二烷基硫酸钠(SDS)购自美国Sigma公司。

2.主要仪器:离心浓缩仪购自美国Labconco公司;纳升级液相色谱Ultimate 3000以及C18预柱和C18反相色谱柱购自美国戴安公司;HCT离子阱质谱购自德国布鲁克仪器有限公司;LC－20AD型高效液相色谱仪购自日本岛津公司;三重四极杆质谱仪API 3200TM LC/MS/MS系统购自美国ABI公司;C18固相萃取柱购自 Waters公司;Ultracel YM－10(分子质量截流值10 kDa，1 Da=0.9921 u)购自Millipore公司。

二、临床队列建立

建立前瞻性临床队列，共146例入选，其中126例为2008年1月～2010年12月上海交通大学附属第一人民医院确诊的CHB病例。CHB病例入选标准:按照中华医学会制定的“慢性乙型肝炎防治指南”［1］所规定的慢性 HBV感染诊断标准;排除条件:艾滋病毒或慢性丙型肝炎病毒感染，酒精摄入量＞30 g/d，代谢性或其他类型的肝损，或已接受肝病治疗，肝活检组织不符合标准者。入选对象均于肝穿刺前一周内取清晨空腹静脉血。行血常规、生化、乙肝二对半定量、HBV－DNA检测，并留取血清标本－80℃保存。入选的CHB病例均行经皮肝活检病理学检查，肝脏炎症程度诊断参照Scheuer标准分期(G0～G4期)。另选取同期本院20名体检人群的血清标本作为健康对照组。所有入组患者均获得知情同意，本研究方案通过上海交通大学附属第一人民医院伦理委员会的审批。

三、血清多肽提取

取50 μL 血清样本，加入 100 μL 沉淀剂(含0.1%甲酸的乙腈)，4℃孵育30 min，12 000 r/min离心后取上清，旋转蒸发仪冻干，－20℃保存待用。提取出的血清多肽标本以离心浓缩仪冻干后，采用20 μL 上样缓冲液(12%SDS，6% β－巯基乙醇，30%甘油，150 mmol/L Tris－HCl，pH=7.0)进行复溶，通过 Tricine－SDS－PAGE 电泳(4%浓缩胶、10%间层胶和16%分离胶)分离检测。

四、液相色谱法联合质谱法(LC－MS/MS)

多肽样品以50 μL上样缓冲液溶解，然后采用10 000 Da的超滤管超滤，滤液直接上样纳升级液相色谱串联高容量离子阱质谱HCT进行分析，样品先经直径5 μm的 C18预柱脱盐，流速为20 μL/min，流动相为2%色谱纯乙腈和0.1%甲酸。然后以300 nL/min的流速经填料粒径为3 μm的C18反向分析柱进行分离，分离流动相溶液A为含0.1%甲酸的2%乙腈水溶液;溶液B为含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液。洗脱条件:0～10 min，4%B，10～70 min，4% ～60%B;70～80 min，90%B;80～100 min，40%B。通过C18色谱柱分离的肽段由纳流喷针进入HCT质谱进行实时离子化分析检测。流经分析柱的色谱流动相A为含0.1%甲酸的纯净水，B液为0.1%甲酸和80%乙腈。质谱设定为m/z范围100～2800，时间范围600～4500 s。所用样品均分析三次，两次MS扫描用于差异分析，一次Auto MS(n)扫描用于多肽鉴定。实验开始前，采用ES TunMix校正仪器。

一级MS数据寻找差异峰:获得的质谱数据经ProfileAnalysis软件(Bruker Daltonics)分析。设定分子质量和出峰时间的误差分别为1 Da和60 s，找出两类样品间差异峰，差异峰需同时满足P＜0.05，m/z＞300，retention time＞10 min(脱盐时间)，差异倍数＞1.5倍，至少在80%的样品中检出该差异峰。所有二级MS/MS数据计算峰强度积分(scored peak intensity，SPI)值。多肽峰质谱仪离子源产生+2价、肽段得分＞10分的离子或离子源产生+1价或+3价、肽段得分 ＞13分的离子，同时SPI值＞70视作有效峰。

差异多肽峰的确认:Auto MS(n)数据经DataAnalysis软件分析后，生成MGF文件，用Mascot软件检索数据库，进行多肽鉴定。搜库参数:一级质谱MS的误差为±1.2 Da，二级质谱MS/MS的误差为±0.6 Da;可变修饰为甲硫氨酸氧化;质谱仪离子源产生+1、+2、+3价的离子;质谱数据模式为单同位素峰。肽段得分＞15分的多肽经人工检查去除假阳性结果后，认为鉴定可靠。

笔者等［5］的前期研究已证实差异多肽片段m/z 520.3可用于诊断肝纤维化，故选取该片段行后续研究。

五、多肽m/z 520.3的多反应监测(MRM)

采用岛津高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱API 3200TMLC/MS/MS系统行MRM分析。血清多肽标本置入含2%乙腈、0.1%甲酸的50 μL液体中，4℃ 12 000 r/min离心30 min取上清。使用戴安1.0 mm×150 mm 300 Å C18色谱柱，流速为0.06 mL/min。液相色谱梯度和流动相参数为:①0～12 min，4% ～45%乙腈，0.1%甲酸流动相;②12～20 min，45%乙腈，0.1%甲酸流动相;③20～25 min，80%乙腈，0.1%甲酸流动相;④25～50 min，4%乙腈，0.1%甲酸流动相。API 3200质谱仪基本参数:MRM mode;IS:5500;CAD:60;DP:50;EP:8;CE:35。多肽m/z 520.3行4个离子对扫描，分析软件捕获每个目标肽的产物离子对和离子对的峰面积积分值，同时计算差异肽的产物离子对和内参肽离子对的累积峰面积，最终得到累积峰面积比值(summed peak areas ratio，SPAR)。

六、统计学分析

结 果

一、前瞻性临床队列的建立

40例CHB病例血清标本用于LC－MS/MS法，分为轻度炎症组(G0期10例，G1期10例)和重度炎症组(G3期10例，G4期10例)。20名对照组和86例CHB病例(G0期13例，G1期22例，G2期20例，G3期16例，G4期15例)血清标本用于MRM检测。所有入选者的临床资料见表1。

二、LC－MS/MS 法

LC－MS/MS法筛检出轻度与重度炎症组血清之间共存在936个差异多肽峰。ProfileAnalysis软件计算差异多肽峰的SPI值显示，9个多肽峰的差异有统计学意义(P＜0.05)。与重度炎症组相比，轻度炎症组7个多肽分子峰强度上调表达，2个多肽分子下调表达(见表2)。

表1 队列的临床资料

表2 轻度与重度炎症CHB患者血清显著差异多肽分子

三、MRM分析

多肽m/z 520.3的结构LLSKLSVLLLEKMG+Oxidation(M)，IP号100551024，分子生物信息学验证其蛋白名为二羟丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase，DAK)。多肽分子m/z 520.3可产生4个离子对，其SPAR值与HBeAg阳性和HBV－DNA无相关性(见图1A、1B)，但随着肝炎症程度(G0～G4期)的加重而呈不同程度的下降趋势(见图1C)。说明血清m/z 520.3肽离子水平与肝脏炎症程度负相关。

四、诊断炎症程度的AUROC评估

多肽离子对 520.3/176.1、520.3/353.7、520.3/459.8、520.3/503.3区分CHB炎症G2～G4期与G0～G1期的 AUROC 值分别为 0.840、0.843、0.694、0.856(见图2A)，区分G3～G4期与G0～G2期的AUROC值分别为0.886、0.790、0.731、0.888(见图2B)。

图1 多肽m/z 520.3的4个离子对SPAR定量值箱图

图2 多肽m/z 520.3的离子对诊断CHB炎症分期的AUROC图

讨 论

通过肝活检标本行组织学检查一直是明确肝病病因、评估肝脏炎症、坏死和脂肪变性程度的金标准。目前针对慢性肝炎肝组织炎症的非创伤性诊断研究很少，其中具有代表性的血清 ActiTest诊断模型［6，7］是针对慢性丙型肝炎而建立的，符合我国国情的CHB肝组织炎症非创伤性预测模型仍缺乏。

血清多肽组学具有创新性，已应用于筛查肿瘤等疾病的诊断标记物，但尚未涉及肝病诊断。本研究首次采用LC－MS/MS联合MRM的多肽组学技术筛查CHB肝脏炎症诊断的血清标记物。已有前期研究［5］证实DAK多肽m/z 520.3与肝纤维化分期高度关联，且具诊断效力。本研究采用LC－MS/MS法筛选显示，轻度与重度肝脏炎症组间存在9个差异多肽，其中包括多肽m/z 520.3。进一步MRM定量研究发现，血清m/z 520.3解离的4个离子对的SPAR值与肝脏炎症程度呈负相关(P＜0.05)，离子对520.3/176.1和520.3/503.3对肝脏炎症程度具有较好的诊断效力(AUROC范围0.840～0.888)。

传统检测技术ELISA和蛋白质印迹法对血清DAK蛋白的敏感性不高，因此一直未发现其与肝脏炎症或纤维化的相关性。生物信息学证实分子多肽m/z 520.3是DAK的肽片段。DAK具有双向ATP依赖性，人肝脏DAK蛋白结构特性和功能在2005年首次被确认［8］。此外，DAK是特异性抑制MDA5介导的抗病毒信号转导通路的关键酶之一［9］。Perdomo等［10］的研究发现包括 DAK 在内的5个标记物与丙型肝炎患者预后相关，其判断药物治疗应答与否的准确率高达85.7%。上述研究结果提示DAK与慢性肝炎的发生、发展相关，但具体作用机制有待阐明。

血清蛋白多肽组学技术起步较晚，但其用于筛查诊断分子蛋白的敏感性明显优于血清抗体ELISA检测技术［11］。本研究发现血清DAK多肽分子m/z 520.3可作为CHB肝脏炎症分期的诊断标记物，具有广阔的应用前景，但其在CHB人群中的诊断价值还需行大样本研究进一步验证。

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5 Xu MY，Jia XF，Wang Y，et al.Dihydroxyacetone kinase fragment:a new hepatic fibrotic stage predictor of plasma peptidomics in patients with chronic hepatitis B［J］.J Hepatol，2012，56 Suppl 2:S416－S417.

6 Poynard T，Munteanu M，Ngo Y，et al.ActiTest accuracy for the assessment of histological activity grades in patients with chronic hepatitis C，an overview using Obuchowski measure［J］.Gastroenterol Clin Biol，2010，34(6－7):388－396.

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9 Diao F，Li S，Tian Y，et al.Negative regulation of MDA5－but not RIG－I－mediated innate antiviral signaling by the dihydroxyacetone kinase［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(28):11706－11711.

10 Perdomo AB，Ciccosanti F，Iacono OL，et al.Liver protein profiling in chronic hepatitis C:identification of potential predictive markers for interferon therapy outcome［J］.J Proteome Res，2012，11(2):717－727.

11 Savino R，Paduano S，Preianò M，et al.The proteomics big challenge for biomarkers and new drug－targets discovery［J］.Int J Mol Sci，2012，13(11):13926－13948.