注射用盐酸胺碘酮细菌内毒素检查法研究

陈 琪 许姿敏

广东省食品药品检验所药理室，广东广州 510180

注射用盐酸胺碘酮属为抗心绞痛药，能选择性扩张冠状动脉血流量，同时减少心肌耗氧量，减慢心率，降低房室传导速度，与β-受体阻滞剂的效应相似。用于室上性和室性心动过速、阵发性心房扑动和颤动、预激综合征，也可用于顽固性阵发性心动过速、慢性冠状动脉功能不全及心绞痛等[1-2]。当不宜口服给药时应用本品治疗严重的心律失常，尤其适用于下列情况：房性心律失常伴快速室性心律、W-P-W综合征的心动过速和严重的室性心律失常[3]。本文根据《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2010年版二部附录ⅪE“细菌内毒素检查法”中所述的药品细菌内毒素的检查方法及其干扰试验的基本原理，对注射用盐酸胺碘酮的细菌内毒素检查进行了研究[4]。本文列出了相同厂家3个不同批次的样品在不同厂家鲎试剂（TAL）下的干扰试验数据，阐明了对注射用盐酸胺碘酮进行细菌内毒素检查的可行性，进一步建立了细菌内毒素检查方法。现报道如下：

1 仪器与试剂

1.1 仪器

旋涡振荡器 （IKA-MS-1）；恒温水浴箱 （德国Julabo 19A）。

1.2 试剂

细菌内毒素检查用鲎试剂 （灵敏度：0.125 EU/mL；规格：0.1 mL/支；批号：1011181）、BET 水（批号：1101040；规格：5.0 mL/支），购于广东湛江安度斯生物有限公司。细菌内毒素检查用鲎试剂（灵敏度：0.125 EU/mL；规格：0.1 mL/支；批号：1102130）购于广东湛江博康海洋生物有限公司。细菌内毒素标准品（批号：150601-201174；效价：160 EU/支）购自中国食品药品检定研究院。

2 实验方法及结果

2.1 鲎试剂灵敏度（λ）的复核

上述两个批号鲎试剂（1011181、1102130）经由细菌内毒素标准品（150601-201174）标定，结果均在 0.5～2.0 λb（标准灵敏度）之间，符合《中国药典》的相关规定，可用于试验。

2.2 样品细菌内毒素限值（L）的确定

细菌内毒素限值L=K/M[3]，式中K为成人每千克体重每小时最大可接受的细菌内毒素剂量，《中国药典》规定注射剂 K=5 EU/（kg·h）；M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按60 kg计算，按照注射用盐酸胺碘酮说明书的用法与用量，本品成人一日总量1 200 mg，4 h 内滴注完毕，L=K/M=5 EU/（kg·h）/1 200 mg×60 kg×4 h=1.0 EU/mg[5]。

2.3 最小有效稀释浓度（MVC）的确定

限值L为1.000 EU/mg时，根据公式MVC＝λ/L，当选用鲎试剂灵敏度为λ＝0.125 EU/mL时，供试品溶液中盐酸胺碘酮的最大有效稀释倍数为MVC=λ/L＝0.125 mg/mL。

2.4 样品干扰预实验

采用灵敏度为0.125 EU/mL的细菌内毒素检查鲎试剂，对批号为100601的供试品进行稀释检验，分别稀释为浓度 0.500、0.250、0.125、0.060 mg/mL。具体过程如下：取本品1瓶（0.15g/瓶）加BET水稀释至30.0mL（稀释浓度为5.000mg/mL），取浓度为5.000 mg/mL的稀释液1.0 mL加BET水至10.0 mL（浓度为0.500 mg/mL），取浓度为0.500 mg/mL的稀释液5.0 mL加 BET水至 10.0 mL（浓度为 0.250 mg/mL），取浓度为0.250 mg/mL的稀释液5.0 mL加BET水至10.0 mL（浓度为0.125 mg/mL），取浓度为0.125 mg/mL的稀释液5.0 mL 加BET 水至 10.0 mL（浓度为 0.060 mg/mL）[6]。试验中另设阳性对照（PC）和阴性对照（NC），每个浓度设2管平行管，结果详见表1。

表1 供试品（批号100601）干扰预试验结果

由表1可以判断当盐酸胺碘酮浓度为0.500 mg/mL时，供试品有增强TAL与细菌内毒素之间凝集反应的作用，稀释至浓度0.250 mg/mL时，干扰现象消除。可以选择灵敏度λ为0.125 EU/mL的TAL，稀释样品至0.125 mg/mL进行干扰确证试验。

2.5 供试品干扰试验

取1个厂家的3批注射用盐酸胺碘酮，用BET水进行稀释，稀释浓度为0.125 mg/mL，选用两个厂家灵敏度为0.125 EU/mL的鲎试剂进行干扰试验，结果显示，Et值均落在0.5～2.0 Es范围内，且相应的Et/Es比值均在0.5～2.0之间，表明注射用盐酸胺碘酮稀释至0.125 mg/mL或者以下浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用。见表2。

2.6 供试品细菌内毒素检查

本品共3批，按《中国药典》2010年版二部附录XI E“细菌内毒素检查法”[3]，分别进行细菌内毒素检查，结果显示，供试品注射用盐酸胺碘酮在稀释至0.125 mg/mL及以下浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用。本研究中将注射用盐酸胺碘酮的细菌内毒素检查限值定为：每1 mg盐酸胺碘酮中含细菌内毒素的量应小于1.0 EU。对3批样品分别按拟订标准进行检验，其细菌内毒素检查结果均符合规定。见表3。

表2 干扰试验结果

表3 注射用盐酸胺碘酮细菌内毒素检查结果

3 讨论

供试品预干扰试验的目的是评价供试品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质，由试验结果可得出对检查无干扰的样品浓度范围及相应TAL的灵敏度，减少后续实验的盲目性。目前市售的鲎试剂灵敏度（λ）一般在0.50～0.03 EU/mL，因此注射用盐酸胺碘酮进行细菌内毒素检测时不同的鲎试剂所对应的最小有效稀释浓度 分 别 为 0.500 mg/mL、0.250 mg/mL、0.125 mg/mL、0.060 mg/mL、0.030 mg/mL。由表2可见，当盐酸胺碘酮浓度为0.500 mg/mL时，供试品有增强TAL与细菌内毒素之间凝集反应的作用，稀释至浓度0.250 mg/mL及以下浓度时，增强作用消失，干扰现象消除。可确定不出现干扰的第1个样品稀释浓度为注射用盐酸胺碘酮的0.250 mg/mL稀释液。因此正式干扰实验时，可选择鲎试剂灵敏度为0.25～0.03EU/mL[7]。

不同厂家的鲎试剂在生产工艺、抗干扰能力等方面存在差异。因此，本研究采用两个不同厂家的、灵敏度0.125EU/mL的鲎试剂，对3个批号样品进行正式干扰实验，其Et/Es均在0.5～2.0范围内，说明样品在该浓度下对细菌内毒素检查法（凝胶法）无干扰。因此，可将注射用盐酸胺碘酮的细菌内毒素限值L定为1.0 EU/mg，选择灵敏度λ为0.25～0.03 EU/mLTAL，并将样品稀释到相应浓度检查细菌内毒素限度[8]。

试验表明，本品可按《中国药典》2010年版二部附录ⅪE第一法（凝胶法）检查细菌内毒素，限值设为：每1毫克盐酸胺碘酮中含细菌内毒素的量应小于1.0 EU。经检验，3批样品内毒素检查均符合规定。

国家食品药品监督管理局国家药品标准 （WS1-（X-211）-2004Z）中仅规定了注射用盐酸胺碘酮热原检查的剂量为：加灭菌注射用水配制成每1毫升约含盐酸胺碘酮30 mg的溶液，按家兔体重每千克注射1 mL，应符合规定。《中国药典》2010年版、美国药典、日本药典、欧洲药典7.0版、英国药典2010年版均未对注射用盐酸胺碘酮细菌内毒素限值作出规定[9]。但由于本次试验只收集到1个厂家样品进行细菌内毒素检查的方法学研究实验，样品批次较少，建议进一步收集多厂家多批次样品进行细菌内毒素检查的方法学研究实验，如按上述实验进行，结果符合细菌内毒素检查方法学的要求，可按本研究中拟定注射用盐酸胺碘酮细菌内毒素检查标准对其质量进行控制。

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