海洋浮游病毒生态学研究方法概述

徐永乐

【摘 要】海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物有机体，在海洋生态系统中发挥着中要的作用。海洋浮游病毒的生态学研究一直是海洋生态学研究的热点。其研究方法也在不断发展和完善。本文分别对病毒丰度、生产力的测定方法、多样性的检测方法以及分离培养鉴定方法及其发展等方面进行了总结和阐述，并对各部分研究方法的优缺点进行了讨论分析。

【关键词】海洋浮游病毒；研究方法；丰度；生产力；多样性；分离培养

海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物实体[1]。海洋浮游病毒在海洋生态系统中发挥着重要的作用，对宿主的侵染和裂解作用，介导着大约20% 的宿主死亡率，大大加快了物质循环的速度[1]，并且调节着宿主群落结构的组成。与此同时，病毒也扮演着介导水平基因转移，促进宿主类群进化的重要角色[1]。除此之外，海洋病毒宏基因组学的研究表明海洋浮游病毒类群有着巨大的多样性，并且包含着大量未知的基因[1， 2]。海洋浮游病毒重要的生态作用必然使海洋浮游病毒生态学的研究成为热点。

目前，海洋浮游病毒的生态学研究主要从丰度，多样性，病毒介导的宿主死亡率，病毒与宿主的相互作用等方面开展。而目前在各方面生态学研究中使用的方法可总结如下。

1. 海洋浮游病毒丰度的检测方法

目前用于水生生态环境中浮游病毒丰度的测定方法主要有以下3种： 透射电子显微镜技术（TEM），表面荧光显微镜技术（EFM） 和流式细胞分析检测技术（FCM）[3， 4]。

1.1 透射电子显微镜技术 （TEM）

透射电子显微镜技术是早期海洋病毒学研究中病毒定量最常用的方法。使用这项技术时，要求浓缩海水中的病毒，把浓缩液滴置于铜网上，负染后镜检观察。这项技术在检测病毒丰度的同时还能获取病毒形态方面的信息[5]。但该项技术的检测的下限高，涉及到海水浓缩，染色，观察等诸多可能产生误差的环节，并且步骤繁琐，对操作人员的技术，仪器的要求都较高[6]。

1.2 表面荧光显微镜技术 （EFM）

表面荧光显微镜技术是目前检测病毒丰度使用最为普遍的方法。其测定操作的步骤为： 将水样浓缩过滤于孔径为0.02 μm的滤膜上，然后用荧光染料染色固定，再放在荧光显微镜下观察计数。EFM比TEM检测更加精确，快速和节约成本。但是这种方法的缺点是： 无法识别病毒的形态特征以及感染能力；无法区分大的病毒颗粒和细菌[1]；在计数时是否会把一些被染色的非病毒颗粒计算上也存在着疑问。

1.3 流式细胞计数法 （FCM）

FCM是一种高度灵敏的检测病毒丰度的手段，能够对样品进行快速精确的分析。FCM对于环境样品的检测不存在一个检测限的问题，而且能够基于病毒颗粒体积大小和荧光强度区分自然水样中不同的病毒类群。FCM分析也存在和EFM相似的缺点[1]。

2.病毒生产力的估算方法

由病毒介导的宿主死亡率可以通过病毒生产力的测定来估算。目前为止使用过的病毒生产力的测定方法有以下几种[7]。

2.1 间接的方法—计算病毒死亡率

由于海水中的病毒的数量是稳定不变的，那么病毒的生产力应该和死亡率是相同的，所以可以通过检测病毒的死亡率来估算病毒的生产力。计算病毒的死亡率有几种不同的方法。首先，在自然海水样品中加入抑制宿主活动的药剂来抑制新的病毒的产生，进而计算自然海水中病毒群落的变化，进一步计算死亡率[8]。其次，向海水中加入某种特定的病毒，培养一段时间后检测该种病毒的效价的变化，进而估算整体病毒的数量变化[9]。再次，向海水中加入荧光标记的病毒，黑暗培养，检测荧光病毒的数量及病毒总体数量的变化，从而计算病毒群落的死亡率[10]。

2.2 TEM 检测宿主死亡率

用TEM 检测受感染细胞是估算由病毒引起的宿主死亡率和病毒生产力最早的方法之一[11]。具体为在TEM上观察细胞中有明显可见的病毒颗粒的细胞出现的频率，从而计算宿主的死亡率，并根据估计的每个细胞病毒裂解量大小来估算病毒生产能力。

2.3 放射性同位素标记

该种方法是在海水样品中把病毒分离出来后，加入3H， 32P 或 14C等放射性同位素标记的胸腺嘧啶或亮氨酸进行培养，然后通过闪烁计数计算结合到病毒核酸或蛋白上放射性同位素的数量，进而估算病毒生产力[12]。这种方法会因细菌的存在而产生较大的误差和不稳定性。

2.4 稀释法

稀释法是目前最为推崇的病毒生产力的估算方法[7]。具体方法是使用切向过滤系统分离细菌和病毒，最终稀释海水中的病毒，避免或减少这一时刻的细胞在释放病毒之前受到新的侵染，分时取样，检测病毒在这一过程中的变化，从而计算病毒的生产力及病毒介导的宿主的死亡率[7， 13]。

3. 海洋浮游病毒多样性的研究方法

病毒被认为是地球上生物多样性最高的生物实体之一。目前人们对病毒多样性的了解还十分有限。不像细菌中存在如16S rRNA基因通用的分子标记那样，病毒中没有十分保守通用的基因，所以其多样性研究的难度较大[1]。目前应用于病毒多样性研究的的分析方法有以下几种：

3.1 基于PCR的保守基因的分析

尽管整个病毒群落没有通用的保守分子标记，但对病毒进行全基因组比对分析时，在一些感染相关宿主的病毒类群中发现有一些基因具有保守性。例如真核藻类病毒的DNA聚合酶基因，蓝细菌病毒的衣壳组装蛋白基因g20，依赖于RNA的RNA聚合酶基因等基因[14-16]。通过针对这些基因设计简并引物，并用其扩增环境样品，从而研究海洋生态环境中某些类群病毒的多样性特征。

3.2 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

由于海洋浮游病毒基因组大小分布范围广，从几kb到几百kb不等，因此病毒基因组大小的分布情况在一定程度上可以反映群落结构的多样性。脉冲电场凝胶电泳 （PFGE） 是一项基因组指纹图谱分析技术，把不同大小的基因组以不同的条带分离开来，根据可识别的条带，揭示从海洋样品中提取出来的病毒在基因组大小组成上的多样性。并且条带的深浅可以在一定程度上反映不同类群病毒的丰度[17]。但需要注意的是不同的病毒可能会有相同或相近的基因组大小，所以PFGE只能提供病毒多样性分析的最小估计。把条带从胶上切割回收，用特异探针进行杂交分析或PCR分析，可以增加PFGE分析的分辨率[18]。

3.3 病毒宏基因组分析

虽然自然环境中的病毒群落很大，但因其基因组小，相对于细菌和古菌，建立病毒群落的宏基因组分析要容易很多。病毒宏基因组的方法是用鸟枪法建立环境病毒基因组文库，然后通过测序来分析多样性。病毒宏基因组学分析使环境中病毒的总类群的组成和结构的分析成为可能，在最大程度上反映病毒群落的多样性特征。当然这个方法也面临着一定的挑战，如环境中存在着大量的游离的DNA，会在一定程度上造成污染；病毒中存在能杀死克隆宿主的基因，不能克隆的基因以及修饰过的DNA，并且RNA和单链DNA 病毒的检测在此方法中也受到一定的限制[19]。

4.海洋浮游病毒纯株的分离及其基本特征的测定

海洋浮游病毒纯株的分离是在个体细胞及种群水平上研究病毒生态作用的基础， 可以为研究病毒-宿主相互作用，病毒的基因组学分析提供更为详细的信息，从而更深入地探究病毒在生物地球化学过程及进化历程中的作用[20]。

4.1 病毒的分离

病毒分离可以分为如下几个步骤：首先是富集，主要通过分离样品与宿主的共培养来实现。对于病毒浓度比较低的样品，可在培养前进行浓缩，已提高侵染成功与富集的可能性。其次是侵染实验，这部分可以根据宿主是否能在固体培养基上生长而分为双层平板法和液体法。双层平板法通过是否有噬菌斑的出现来判定，而液体法通过重复侵染后宿主细胞培养液是否被裂解来判定，如果现象不明显则可通过计数，看病毒量是否增加。再次是纯化，可以在固体培养基上生长的宿主可以通过双层平板法每次挖单斑实现，而不能在固体培养基上生长的宿主则通过梯度稀释法来实现纯化[20]。经过3-5次的纯化，即可认为得到的病毒为纯株。

4.2 病毒基本特征的鉴定

纯化后的病毒可以通过一步生长曲线来测定在特定宿主中的潜伏期与单细胞裂解量的大小；通过氯仿敏感实验来判断病毒粒子中是否含有脂类物质；通过透射电镜判定病毒的形态；通过全基因组测序和蛋白质组分析来了解其基因和蛋白组成等。从而从个体水平上细致深入的了解病毒，并为其他生态学研究提供详细的信息与基础。

参考文献：

[1] Suttle， C.A. Viruses in the sea [J]. Nature， 2005， 437（15）： 356-361.

[2] Rohwer， F.， Thurber， R.V. Viruses manipulate the marine enviro nment [J]. Nature， 2009， 459： 207-212.

[3] Suttle， C.A. Marine viruses-major players in the global ecosystem [J]. Nature Review， 5： 801-812.

[4] 焦念志等. 海洋微型生物生态学[M]. 北京： 科学出版社， 2006.

[5] Borsheim， K.Y.， Bratbak， G. & Heldal， M. Enumeration and biomass estimation of planktonic bacteria and viruses by transmission electron microscopy [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1990， 56（2）： 352-356.

[6] Weinbauer， M.G.， Suttle C.A. Comparison of epifluorescence and transmission electron microscopy for counting viruses in natural marine waters [J]. Aquat. Microb. Ecol.， 1997， 13： 225-232.

[7] Weinbauer M.G.， Rowe J.M.， and Wilhelm S.W.. Determining rates of virus production in aquatic systems by the virus reduction approach [J]. MAVE Chapter 1 2010： 1-8.

[8] Heldal， M.， and Bratbak， G. Production and decay of viruses in aquatic enviro nments [J]. Mar. Ecol. Progr. Ser.， 1991， 72： 205-212.

[9] Garza， D.R.， and Suttle， C.A. The effect of cyanophages on the mortality of Synechococcus spp. and selection for UV resistant viral communities [J]. Microb. Ecol.， 1998， 36（3）： 281-292.

[10] Noble， R.T.， and Fuhrman J.A. Rapid virus productionand removal as measured with fluorescently labeled viruses as tracers [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2000， 66（9）： 3790-3797.

[11] Proctor， L.M.， Okubo， A. and Fuhrman， J.A. Calibrating estimates of phage-induced mortality in marine bacteria： Ultrastructural studies of marine bacteriophage development from one-step growth experiments [J]. Microb. Ecol.， 1993， 25（2）： 161-182.

[12] Steward， G. F.， Wikner， J.， Cochlan， W. P.， Smith， D. C.， and Azam， F. Estimation of virus production in the sea： 2. Field results [J]. Mar. Microb. Food Webs.， 1992a， 6（2）： 79-90.

[13] Wilhelm， S.W.， Brigden， S.M.， and Suttle， C.A. A dilution technique for the direct measurement of viral production： a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters [J]. Microb. Ecol.， 2002， 43（1）： 168-173.

[14] Chen F.， Suttle C.A.， Short S.M. Genetic diversity in marine algal virus communities as revealed by sequence analysis of DNA polymerase genes [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1996， 62： 2869-2874.

[15] Fuller N.J.， Wilson， W.H.， Joint， I.， Mann， N.H. Occurrence of a sequence in marine cyanophages similar to that of T4 g20 and its application to PCR-based detection and quantification techniques [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1998， 64： 2051-2060.

[16] Culley， A.I.， Steward， G.F. New genera of RNA viruses in subtropical seawater， inferred from polymerase gene sequences [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2007， 73： 5937-5944.

[17] Weinbauer M.G. Ecology of prokaryotic viruses [J]. FEMS Microbiol. Rev.， 2004， 28， 127-181.

[18] Wommack， K.E.， Ravel， J.， Hill， R.T. and Colwell， R.R. Hybridization analysis of Chesapeake Bay virioplankton. Appl. Environ. Microbiol.， 1999， 65： 241-250.

[19] Edwards R.A. and Rohwer F. Viral metagenomics [J]. Nature Reviews， 2005， 3： 504-510.

[20] Middelboe， M.， Chan A.M.， and Bertelsen S.K. Isolation and life cycle characterization of lytic viruses infecting heterotrophic bacteria and cyanobacteria [J]. MAVE Chapter 13， 2010： 118-133.