柴油脱氮菌的应用研究

唐 克，洪 新

（辽宁工业大学化学与环境工程学院，辽宁 锦州 121001）

柴油中含有少量的氮化物，二次加工柴油中氮化物含量更高，氮化物的存在直接或间接影响柴油的颜色和氧化安定性，对柴油的质量影响较大。并且在柴油的催化加工过程中，氮元素易使催化剂中毒［1－2］。另外氮化物在燃烧时产生的大量NOx会对大气造成严重污染［3］。目前，油品中氮化物的脱除方法主要有加氢精制和非加氢精制，采用加氢精制法可对柴油进行深度脱氮，但脱除含氮杂环化合物（如喹啉等）需在较苛刻的高温、高压下操作，不仅所需的费用高，且危险系数高；非加氢精制方法主要有络合萃取精制［4］、酸碱精制［5］、溶剂精制［6］等，虽然这些方法各有优势，但也都存在一定的不足，最主要的是操作条件苛刻，产生二次污染。近些年发展起来的微生物脱氮技术以其投资费用低、设备简单、操作条件温和、不产生二次污染等优点逐步受到各行各业的青睐，并在石油微生物脱硫、微生物石油勘探、石油二次开采、脱蜡等方面取得了很大的成绩，有些已实现了工业化［7］。喹啉作为油品中典型的含氮杂环化合物，其微生物脱除方法已经得到了广泛的研究，Edward［8］，Schwarz［9］，O’Loughlin［10］分别筛选出了降解喹啉较好的菌株。本研究在前期工作［11］中已经分离筛选出降解喹啉较好的菌株HY9，但该菌株用于柴油脱氮时脱氮率较低，因此对营养盐与柴油体积比、表面活性剂Tween80加入量及摇床转速等各因素对菌株脱除柴油中含氮杂环化合物的影响进行研究，为微生物在油品脱氮中的应用提供理论依据。

1 实 验

1.1 样品和培养基

菌株来源于实验室培养的HY9菌株；培养基［12］：KH2PO40.265g，Na2HPO40.426g，FeSO4·7H2O 0.001g，MgSO4·7H2O 0.02g，CaCl2·2H2O 0.002g，去离子水100mL，葡萄糖2g，pH值为7.0。

1.2 分析方法

碱氮含量的测定采用SH／T 0162—1992方法；细胞生长量测定采用比浊法；喹啉浓度的测定采用紫外分光光度法。

2 结果与讨论

2.1 无机氮对喹啉降解的影响

据文献报道［13－14］，喹啉在微生物降解过程中，其中的氮是以氨氮的形式溶于培养基中。因此，为确定溶解在培养基中的铵氮是否影响菌株进一步降解喹啉，实验中选择（NH4）2SO4作为无机氮源，研究（NH4）2SO4的加入对喹啉降解的影响。配制100 mL液体培养基6份，其中3份分别添加0.2g（NH4）2SO4、喹啉用量分别为0.07，0.14，0.18mL；另外3份不加无机氮（NH4）2SO4，喹啉用量分别为0.07，0.14，0.18mL。在温度为35℃、转速为125 r／min、pH值为7.0的条件下，摇床培养4天，测定OD600（消光系数）和脱氮率，结果见表1。从表1可以看出，无机氮的加入对于菌株HY9的生长及喹啉降解无明显影响，但喹啉用量对其影响较大，当喹啉用量为0.07mL时，菌株生长情况及脱氮率均低于喹啉用量为0.14mL时的情况，这是由于菌株生长及其对喹啉的代谢降解过程同步进行，喹啉作为菌株生长的氮源，为微生物生长提供所需氮源，促进菌株的生长，低的喹啉用量不能满足菌株生长所需的氮源，故生长和降解能力均较低；但当喹啉用量为0.18mL时，其OD600和喹啉脱氮率也低于喹啉用量为0.14mL时的情况，这是因为喹啉有毒，大剂量的喹啉不但会抑制菌株生长甚至可能使微生物死亡，也有可能是由于菌株生长代谢产物的积累抑制了菌株的生长。为了进一步考察喹啉加入量对菌株生长的影响，仅改变液体培养基中喹啉加入量，考察菌株生长情况，结果见图1。由图1可见，菌株对喹啉的最大耐受用量为0.14mL，超过0.14mL时，菌株生长受到限制。因此确定16.7mL培养基中喹啉加入量不得超过0.14mL。

表1 无机氮对HY9菌株生长及喹啉降解的影响

图1 喹啉加入量对菌株生长的影响

2.2 营养盐与柴油体积比对柴油脱氮的影响

根据HY9降解喹啉实验所确定的最佳培养条件，扩大培养HY9菌株，制备菌悬液（菌浓度108个／mL），用于柴油脱氮处理。分别称取25 mL柴油于4个锥形瓶，按营养盐与柴油体积比分别为1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1加入营养盐，灭菌后，分别加入3mL菌悬液，在35℃、转速为125 r／min的条件下，摇床培养4天，静止分层后，测定柴油脱氮率，结果见表2。从表2可以看出，柴油与营养盐混合比例对柴油脱氮的效果影响不大。这主要是因为柴油水溶性差，在营养盐中的溶解度较低，而微生物脱氮对象是油和水构成的混合液，油在水中乳化性差，水中油含量低，微生物发酵降解所进行的生化反应都是在水相中进行的，所以菌体接触柴油的几率较小，脱氮效果差，设法提高柴油在营养盐中的溶解度是提高菌株的柴油脱氮率的关键。考虑实际操作情况及费用，选取营养盐与柴油的体积比为1.5∶1。

表2 营养盐与柴油体积比对柴油脱氮效果的影响

2.3 表面活性剂对柴油脱氮的影响

采用多元醇类非离子型表面活性剂Tween80来增强油水混溶性，非离子型表面活性剂在水溶液中不发生电离，亲水基部分为多聚氧乙烯基，其亲水性能由所含的氧乙烯基的数目来控制，不但稳定性较高，而且不易受酸碱和强电解质无机盐的影响。称取0.15g Tween80、37.5mL营养盐和25mL柴油加入到250mL锥形瓶中，灭菌后于35℃、125r／min摇床转速条件下培养4天，培养后将混合液静置分层，由于Tween80的增溶作用，需静置较长时间。分层后取上层油，采用高氯酸滴定法测定碱氮含量，结果见表3。从表3可以看出，加入Tween80后，柴油的脱氮效果明显增加，脱氮率由12.9%增加到16.7%。

表3 Tween80对柴油脱氮效果的影响

2.4 表面活性剂加入量对柴油脱氮的影响

分别称取0.100，0.175，0.200，0.250g Tween80，加入到含柴油25mL、营养盐37.5mL的锥形瓶中，灭菌后，加入菌悬液3mL，在35℃、250r／min转速条件下摇床培养4天，测定柴油脱氮率，结果见表4。由表4可见，加入0.175g Tween80时，柴油脱氮率最大，为19.3%。另外，实验现象表明，随着Tween80加入量的增加，油水分层时间延长。因此，确定25mL柴油中最佳Tween80加入量为0.175g。

表4 表面活性剂加入量对柴油脱氮的影响

2.5 摇床转速对柴油脱氮的影响

摇床转速一方面会提高柴油与营养盐的混合效果，另一方面会增加菌株与柴油的接触几率。称取4份0.175g的Tween80，分别加到含37.5mL营养盐和25mL柴油的250mL锥形瓶，灭菌后加入菌悬液3mL，在35℃、摇床转速分别为125，175，250，300r／min的条件下培养4天，测定柴油脱氮率，结果见表5。从表5可以看出，在Tween80存在的条件下，适当提高摇床转速有利于提高柴油脱氮率，转速为250r／min时的脱氮率是125r／min时的1.2倍。这是因为提高摇床转速，可减小油水微粒的粒径、增加溶液中的溶解氧含量，而溶解氧对于提高好氧微生物的降解作用主要体现在以下两个方面：①作为氧化还原代谢过程的最终电子受体；②参与甾醇类和脂肪酸的合成。因此溶解氧的增加促进了柴油的脱氮效果。在表面活性剂存在的条件下，增大摇床转数，可以减小油水形成的微乳状液滴尺寸，增加比表面积，进而增加油水接触界面，提高微生物与柴油中含氮化合物的接触机会，增强生物催化脱氮作用。当转速增加到300r／min时，微生物脱氮效率趋于稳定。因此确定250r／min为最佳摇床转速。

表5 摇床转速对柴油物脱氮效果的影响

2.6 接种量对柴油脱氮的影响

按营养盐与柴油体积比为1.5∶1配置6组100mL的混合液，分别加入0.175g Tween80，高温灭菌后，分别加入0.5，1，2，3，4，5，6mL菌悬液（菌浓度108个／mL），在35℃、250r／min的条件下摇床培养4天，测定柴油脱氮率，结果见图2。由图2可见，接种量低于3mL时，最初由于接种量过少，生长缓慢，发酵周期长，脱氮率较低，但随着接种量的增加，柴油的脱氮率增加，由最初的6.86%增加到接种量为3mL时的19.5%，这是因为随着接种量的增加，接入的菌株量增加，与柴油中含氮化合物的接触几率增加，使脱氮率增加；接种量高于3mL时，柴油的脱氮率并没有明显的增长，而接种量过高时会提高成本。因此确定100mL混合液加入3mL菌悬液为最佳接种量。

图2 接种量对柴油脱氮效果的影响

2.7 脱氮次数对柴油脱氮的影响

以上实验结果表明，菌株HY9对柴油的脱氮效果不是很理想，最高脱氮率也仅为19.5%左右，若要提高脱氮率可进行多次降解，因此考察了脱氮次数对柴油脱氮效果的影响。将一次脱氮后的柴油分层萃取灭菌后，按上述实验方法和实验条件加入营养盐和表面活性剂，在35℃、250r／min的条件下摇床培养4天，将混合液分层萃取，取上层柴油测定脱氮率，如此重复进行3次。结果表明，脱氮次数分别为1～4次时，对应的脱氮率分别为19.3%，19.8%，21.1%，21.2%。增加柴油脱氮次数，脱氮率仅有小幅提高，脱氮效果并不是很明显，这有可能是该菌株只对部分含氮杂环化合物有降解作用，而对另外一些含氮杂环化合物的降解能力极弱或不能降解，所以通过多次降解来提高柴油脱氮效果的方式不可取。若要进一步提高菌株的脱氮效果，应加强菌株的分子生物学及酶学研究，进行基因重组，构建优良菌株，提高脱氮效果。影响微生物脱氮的另一个关键问题是菌株对喹啉等有机氮化物的吸收能力，它与菌株和有机相的接触情况及有机氮化物在液相中可溶性有关，因为与微生物脱氮效果密切相关的三个因素为微生物对有机氮化物的依附情况、辅助吸收机制及物质的扩散。加强传质过程研究，采取一定有效措施，进一步增加菌株的疏水性，提高其亲油性，将会有效提高柴油的脱氮效率。

3 结 论

（1）采用HY9菌株降解喹啉时，无机氮源（NH4）2SO4的加入对喹啉的降解基本无影响，16.7 mL培养基中菌株对喹啉的耐受用量为0.14mL。

（2）非离子表面活性剂Tween80的加入，增强了油水混溶性，柴油脱氮率从12.9%增加到16.7%，脱氮率明显提高，具有较好的增溶性；25mL柴油中Tween80的最佳添加量为0.175g；摇床转速影响菌株对柴油中含氮化合物的降解能力，最佳摇床转速为250r／min；100mL混合液加入3mL菌悬液为最佳接种量；最佳营养盐与柴油体积比为1.5∶1；增加脱氮次数对柴油的脱氮效果影响较小。

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