反相高效液相色谱法测定废弃食用油脂中胆固醇

郭华，周贻兵，林野，张卫国，汪思顺

（贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳 550004）

废弃食用油脂，因来源不同俗称为“潲水油”、“地沟油”、“煎榨油”等，是指食品生产经营单位在经营过程中产生的不能再食用的动植物油脂[1]。出于利益驱使，不法分子将废弃食用油脂经过酸炼、脱色、过滤等加工提炼后 ，又重新以植物油的名义回流到餐饮行业中。然而，目前的国家标准食品卫生检测方法中无植物油中废弃食用油脂标准分析方法[3－4]，无法对掺有废弃食用油脂的植物油进行检测分析。废弃食用油脂成分复杂，加工过程中产生有害物质，甚至是“三致物质”，对人体健康造成很大危害[5－6]，因此建立废弃食用油脂的检测方法迫在眉睫。

目前，国内外对废弃食用油脂的研究工作主要集中于油脂的综合利用方面[7－8]。关于食用油脂卫生的研究主要是针对油脂的掺假行为，少数关于废弃油脂检测方法的研究也是侧重于单一来源废弃食用油脂个别指标的检测[9－10]。本试验以检测油脂中动物油脂的特征性甾醇即胆固醇含量作以判断是否为废弃食用油脂的指标，利用反相高效液相色谱法测定废弃食用油脂中胆固醇含量，旨在为检测部门辨别植物油中是否掺有废弃食用油脂提供一种准确快速的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695型高效液相色谱仪（分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统），配2489 UV/Visible检测器，Empower色谱管理软件：美国沃特世公司；LABOROTA 4001标准型旋转蒸发仪：德国海道夫公司。

胆固醇标准储备液：称取0.00520g胆固醇标准品，于50 mL小烧杯中，加入少量乙醇超声溶解，转移到50 mL容量瓶中，用乙醇洗涤烧杯数次，将洗涤液转入容量瓶中，用乙醇定容到50 mL，摇匀，配置成1 mg/mL的标准储备液。

氢氧化钾、氯化钠、乙醚、石油醚和丙酮均为分析纯，甲醇和乙醇为色谱纯，水为超纯水[18.25（MΩ·cm）]。

1.2 色谱条件

Waters C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为100%甲醇溶液，流量1.0 mL/min，检测波长203 nm，进样体积 20 μL。

1.3 方法

准确称取1.00 g油样于50 mL塑料离心管中，加入5 mL乙醇摇匀，再加入2 mL质量浓度25%氢氧化钾溶液，于100℃水浴中皂化60 min，每隔15 min振摇一次离心管，加速皂化速度。

在皂化后的离心管中加入3 mL水，少量氯化钠，加入20 mL混合溶剂（乙醚与石油醚比例为1∶1，体积比），振摇，静止分层，将上清液转移到100 mL浓缩瓶中，重复萃取2次，合并上层萃取液，浓缩近干，加入乙醇定溶至5 mL，过0.45 μm的有机滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 皂化条件的选择

考察了氢氧化钾质量浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%对皂化的影响，结果表明：随着氢氧化钾浓度的增加，皂化速度加快，氢氧化钾的浓度超过30%时，氢氧化钾剩余较多，溶液呈黏稠状，而氢氧化钾浓度低于20%时，皂化速度较慢，故本实验选择了25%作为皂化反应中氢氧化钾的浓度。

在皂化时，加入乙醇目的是溶解油样，增大样品与氢氧化钾的接触面积，加速皂化速度。考察了乙醇加入量分别为 2、5、10、15、20 mL 对皂化速度的影响。乙醇加入量为2 mL时，溶液成粘稠状，乙醇加入量在10 mL以上时，乙醇对氢氧化钾起到稀释作用，皂化速度减慢，且乙醇含量过高，胆固醇的回收率降低，所以选择乙醇的加入量为5 mL。

在100℃水浴中，油样中分别加入5 mL乙醇、2 mL 25%氢氧化钾溶液，考察皂化时间为30、40、50、60、90、120 min时对提取废弃适用油脂中胆固醇含量的影响。结果发现，随着皂化时间的增加（30 min～60 min），废弃食用油脂中胆固醇的含量逐渐增加，皂化时间大于60 min后，废弃食用油脂中胆固醇的含量没有明显变化，所以选择皂化时间为60 min为反应条件。

2.2 提取条件的选择

为使油样皂化完全，皂化反应中加入过量的氢氧化钾溶液，所以皂化液中有氢氧化钾剩余。加入无水硫酸钠（500℃烘烤4 h）吸收皂化液中剩余的水，再用乙醇提取，提取液显强碱性，直接进样分析会损坏色谱系统，若用10%的硫酸溶液调节皂化液至中性，无水硫酸钠吸收水后，再用乙醇提取，脂肪酸盐也被提取出来，浓缩，定容后部分油样成明胶状，无法进样分析。

分别用20 mL正己烷和混合溶剂（乙醚与石油醚比例为1∶1，体积比）代替乙醇作为提取溶剂提取皂化液中胆固醇，重复提取2次，合并上层萃取液，浓缩，用乙醇定容到5 mL，过0.45 μm的有机滤膜，上机测定。由于正己烷极性较小，胆固醇提取率较低，而混合溶剂（乙醚与石油醚比例为1∶1，体积比）中胆固醇的回收率较高。为了减少脂肪酸盐进入提取液中，将提取液浓缩近干，用丙酮转换混合溶剂，析出大量的脂肪酸盐沉淀，取上清液浓缩近干，用乙醇定容、过膜测定，胆固醇的回收率低（约45%）且在提取过程中易乳化。

本试验选择在皂化液中加入适量的水和氯化钠，再用混合溶剂（乙醚与石油醚比例为1∶1，体积比）提取胆固醇，既可减少脂肪酸盐进入有机相，又能防止乳化，但随着水加入量的增加，胆固醇的回收率逐渐降低，所以选择在皂化液中加入3 mL水。

2.3 标准曲线与检出限

分别吸取 0.30、0.60、1.20、2.00、3.00、4.50 mL 标准储备液于25 mL容量瓶中，用乙醇定容到25 mL，即为0.012、0.024、0.048、0.08、0.12、0.18 mg/mL 的标准使用液。0.5 mg/mL的标准使用液是将标准储备液稀释2倍得到的。以胆固醇的质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行回归分析，线性范围为0.012 mg/mL～0.5 mg/mL，线性回归方程为y=0.000 001x+45 548，相关系数为0.999 7。以3倍的信噪比计算方法的检出限为0.005 mg/g。

表1 方法的精密度（n=6）Table 1 Precision of the method

2.4 方法的精密度与回收率

在空白样品中添加低、高2种不同浓度的胆固醇标准溶液，制成供试样品，按试验方法处理，重复测定浓缩液8次，相对标准偏差结果见表1。

于废弃食用油脂中，在方法的线性范围内分别加入低、高浓度胆固醇标准溶液，用标准加入法测定其回收率，结果见表2。

表2 回收试验结果Table 2 Results of test for recovery

2.5 样品分析

取植物油和废弃食用油脂样品，按1.3节的方法处理，分别精密吸取标准品溶液和样品浓缩液各20 μL，注入液相色谱仪，按1.4色谱条件测定峰面积值，外标单点法计算胆固醇含量，结果见表3。

表3 样品分析结果Table 3 Analytical results of samples

续表3 样品分析结果Continue table 3 Analytical results of samples

3 结论

所建方法具有准确、重现性好、操作简单等特点，适用于废弃食用油脂中胆固醇含量测定，为鉴别掺有废弃食用油脂的植物油提供技术支持。

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[1]毛新武,贾煦,胡国媛,等.潲水油等废弃食用油脂检测指标的建立研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(2):258-260

[2]尹平河,潘剑宇,赵玲,等.薄层色谱法快速鉴别潲水油和煎炸老油的研究[J].中国油脂,2004,29(4):47-49

[3]中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.37–2003食用植物油卫生标准的分析方法[S].北京:中国标准出版社,2003

[4]中华人民共和国卫生部.GB 2716–2005食用植物油卫生标准[S].北京:中国标准出版社:2005

[5]黄俊明,罗剑波.油脂的热化学变化及其产物的毒性与检测[J].中国公共卫生,1993,9(4):166-168

[6]陈媛,周晓光.食用油脂的卫生及其对人体健康的影响[J].武汉食品工业学院学报,1997,16(2):36-38

[7]Demirbas A.Biodiesel from waste cooking oil via base-catalytic and supercritical methanol transesterification[J].Energy convers manage,2009,5(4):923-927

[8]Meng X,Chen G,Wang Y.Biodiesel production from waste cooking oilviaalkalicatalystanditsenginetest[J].FuelProcessTechnol,2008,89(9):851-857

[9]胡小泓,刘志金,郑雪玉,等.应用电导率检测潲水油方法的研究[J].食品科学,2007,28(11):482-484

[10]刘薇,尹平河,赵玲.荧光法测定十二烷基苯磺酸钠鉴别潲水油的研究[J].中国油脂,2005,30(5):24-26