HPLC测定海南产胡椒中胡椒碱的含量

郭飞燕，王友志，王晓青，姚亮，纪明慧，谢乐琼

（海南师范大学“省部共建-热带药用植物化学”教育部重点实验室，海南海口 571158）

胡椒（Piper nigrum）为胡椒科胡椒属植物[1]，是海南的特产之一，海南白胡椒因其质优、味辣在国际市场享有较高的声誉。胡椒碱是胡椒中具有许多药理活性的主要化学物质，目前，已发现胡椒碱具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、促进药物代谢等作用[1-3]，胡椒中胡椒碱的含量因品种、产地，栽培环境的不同而存在差异，因此其含量是胡椒品质评定的重要指标。

目前，已报道的胡椒碱的提取方法和含量测定很多[4-7]，但未见用HPLC法测定海南不同地区产胡椒中胡椒碱的文献报道。本工作拟利用索氏提取法分别对海南不同地区产的胡椒果实及胡椒根和胡椒叶中胡椒碱进行提取，并采用HPLC对胡椒碱的含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

试验用的成熟胡椒果实产于海南临高、万宁、陵水、琼山、文昌、保亭、东方7个地方。样品烘干粉碎，密封保存，备用。

胡椒碱对照品：瑞士，Fluka Chemie AG，CH-9470 Buchs，GR，分子量：285.34。甲醇：色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司；无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、苯等均为分析纯。

高效液相色谱仪（ΜV230+、P230）：大连依利特分析仪器有限公司；EC2000工作站：大连依利特分析仪器有限公司；KQ2200E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DZG-6050真空干燥箱：上海森信实验仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱检测条件

选择色谱柱为大连依利特、250 mm×4.6 mm，5 μL；KromasiL），检测波长 343.0 nm，以甲醇－水（77∶23）为流动相，流动速度1.0 mL/min；柱温为室温[4-6]。

1.2.2 供试液的制备

1.2.2.1 对照品溶液

精密称取胡椒碱标准品0.030 0 g，置于100 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5 mL胡椒碱乙醇溶液，置50 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，待用。

1.2.2.2 供试品溶液

精密称取胡椒干粉0.100 0 g，置250 mL的平底烧瓶中，加入100 mL 80%乙醇，索氏提取48 h。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀释至刻度，待用。

1.2.3 色谱峰的建立

参照文献[6]方法分别取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，进样分析，记录色谱图。进样前先用0.45 μm的滤膜过滤。

1.2.4 对海南不同地区产胡椒中胡椒碱的提取

分别精确称取临高、万宁、陵水、琼山、文昌、保亭、东方7个不同地区产的胡椒果实干粉0.100 0 g，用纱布包裹，于索氏提取器中，加入80%无水乙醇100 mL加热回流提取，用毛细管取回流液点于玻璃硅胶板上，晾干，置于 V（苯）∶V（乙酸乙酯）∶V（丙酮）=7∶2 ∶1（mL/mL）的展开剂中，取出晾干，在365 nm紫外分析仪下检测至无紫兰色斑点[4]，即无胡椒碱检出为止，提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀释至刻度，取20 μL提取液注进高效液相色谱仪进行分析，记录色谱图。

1.2.5 对海南万宁地区胡椒不同部位胡椒碱的提取

分别精确称取万宁胡椒的果实、根、叶各0.100 0g，用纱布包裹，置索氏提取器中，加入80%无水乙醇100 mL，加热回流至胡椒碱提取完全。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀释至刻度，取20 μL提取液注进高相色谱仪进行分析，记录色谱图。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 空白试验

取无水乙醇空白溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果溶剂出峰少，对图谱及含量检测基本无干扰。

2.1.2 色谱峰的建立

以甲醇－水（77∶23）为流动相，检测波长343.0 nm，流动速度1.0 mL/min；柱温为室温。参照文献[4-5]方法分别取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，进样分析，记录色谱图，见图1、图2。

图1 胡椒碱标准品的HPLC图Fig.1 Piperine standard HPLC diagram

图2 胡椒供试品HPLC图Fig.2 HPLC of Piperine samples

2.1.3 线性关系

精密称取胡椒碱标准品0.050 0 g，置50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。分别取 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL 于 10 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。取上述溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以总峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，并计算相关系数及回归方程。胡椒碱在0.020 mg/mL～0.080 mg/mL的浓度范围内线性关系良好，Y=306 319.892 86+1.454 55×108x，r=0.999 7。

2.1.4 精密度试验

准确称取胡椒碱标准品0.030 0 g，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。取20 μL溶液注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。各色谱峰相对保留时间的RSD小于1.00%、相对峰面积值的RSD小于5.00%，表明精密度良好。胡椒碱的含量测定的总峰面积的相对标准偏差为0.41%，符合含量测定要求。

2.1.5 供试品稳定性试验

分别于 0、2、4、8、24 h 各取 20 μL 供试品溶液进行测定。试验结果表明：各色谱峰相对保留时间的RSD小于1.50%、相对峰面积值的RSD小于5.00%，表明溶液24 h内稳定。胡椒碱的含量测定的总峰面积的相对标准偏差为1.32%，符合含量测定要求。

2.1.6 重复性试验

配制同一批供试品溶液6份，各取20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明：各色谱峰相对保留时间的RSD小于1.00%、相对峰面积值的RSD小于5.00%，表明重现性良好。胡椒碱的含量测定的相对标准偏差为0.86%，符合含量测定要求。

2.2 海南胡椒中胡椒碱的提取

2.2.1 胡椒碱的含量测定

取样品溶液的峰面积、标准品溶液的峰面积等数据代入公式计算。

样品浓度（%）=（W对×对照品含量×（1-对照品水分）×A样×样品稀释倍数）/（A对×对照品稀释倍数）

式中：W对为对照品质量，g；A样为样品溶液峰面积，A对标准品溶液峰面积。

2.2.2 海南不同地区胡椒中胡椒碱含量测定

分别精确称取不同地区产成熟胡椒果实干粉0.100 0 g，用纱布包裹，于索氏提取器中，加入80%无水乙醇100 mL，加热回流提取至胡椒碱提取完全，所得提取液用HPLC进行测定，结果见表1。

表1 不同产地胡椒中胡椒碱的含量测定结果Table 1 The determine results of Piperine from different regions of Piper nigrum L.

从表1可以看出，不同地区产胡椒中胡椒碱含量不同，实验结果表明，东南地区种植的胡椒中胡椒碱含量要比中西部地区种植的胡椒中胡椒碱含量高，海南万宁地区产的胡椒中胡椒碱含量高达3.17%。其次为海南陵水产胡椒，其中胡椒碱含量高达2.93%。据文献报道胡椒只能生长在年降水量2 500 mm的热带地区，生长期中还需要一段干热的间隔期[8]。土壤、气温、湿度等因素会影响胡椒的生长和其中总生碱的含量，海南东南部地区较适合胡椒的种植。

2.2.3 海南胡椒不同部位胡椒碱的提取

分别精确称取万宁胡椒的果实、根、叶各0.100 0 g，用纱布包裹，置索氏提取器中，加入80%无水乙醇100mL，加热回流至胡椒碱提取完全。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀释至刻度，取20 μL提取液注进高相色谱仪进行分析，记录色谱图，结果见表2。

表2 胡椒不同部位胡椒碱的含量Table 2 Piperine content in different parts of the Piper nigrum L.

从表2可知，在万宁产的胡椒中，果实、根、叶中胡椒碱的含量分别为3.17%、0.43%、0.01%，根部的胡椒碱的含量比叶中的高，而果实中的胡椒碱含量比根和叶中要高得多。

3 结论

以80%乙醇为溶剂，采用索氏提取法分别从海南不同地区产的胡椒果实及胡椒根和胡椒叶中提取胡椒碱，并以HPLC法测定提取液中胡椒碱含量。结果表明，万宁、陵水地区产的胡椒中胡椒碱含量比较高，分别可达3.17%和2.93%；海南万宁地区种植的胡椒中根部和叶中胡椒碱的含量都很低。产地，栽培环境对胡椒的生长会有一定的影响，会造成其中生物碱的含量的差异。

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[1]韦琨,窦德强,裴玉萍,等.胡椒的化学成分、药理作用及与卡瓦胡椒的对比[J].中国中药杂志,2002,27(5):328-333

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[3]刘屏,索婧侠,于腾飞.胡椒碱药理作用的研究进展[J].中国药物应用与监测,2007(3):7-9

[4]陶元器,邓跃.从黑胡椒中提取胡椒碱[J].云南化工,1991(1/2):92-93

[5]陈寒杰.HPLC测定二十五味鬼臼丸中胡椒碱的含量[J].中成药,2007,29(2):296-297

[6]刘文,孙宇章.胡椒中胡椒碱的提取工艺研究[J].中国中药杂志,2003,28(5):456-457

[7]张华芸,宿松光,林玉梅.高效液相色谱法测定胡矾口腔膜中胡椒碱的含量[J].中国医院药学杂志,2006,26(5):630-631

[8]杨自朋.胡椒中总生物碱提取工艺的研究[J].齐鲁药事,2006,25(11):685-686