芹菜中总黄酮的提取工艺

赵云玲，龚小见，周欣，*，陈华国，赵超

（1.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵州贵阳 550001；2.贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州贵阳 550001）

芹菜（Apium graveolens L.）属伞形花科一年或两年生草本植物，有西芹、旱芹等品种。芹菜不仅具有食用价值，而且是一种“药食同源”的绿色天然产物。传统医药认为，芹菜有“甘凉清胃、涤热祛风、补血健脾、止咳利尿、降压镇静、利口齿咽喉、养精益气、明目”等功用[1]。芹菜中含有丰富的黄酮类化合物，具有降压安神、降血脂、保护血管和增强免疫力的功能。医学研究发现，黄酮类物质是对人体具有生理活性的一类物质，曾被称为维生素P[2]，具有抗氧化、抗衰老[3]、增强机体免疫力、防癌抑癌等功能，提取和测定芹菜内的黄酮类物质对更有效地开发利用该药用植物资源能起到一定的指导作用[4]。文献报道对黄酮类物质的提取方法主要有超声法、温浸法、回流法、超临界CO2萃取法以及微波辅助萃取法[3-6]。本论文对芹菜中黄酮类化合物进行了提取工艺的研究，旨在为芹菜的进一步开发与应用提供基础科学参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

紫外-可见分光光度计（Cary-100型）：美国瓦里安公司；石英比色皿（1 cm）；电子天平（AL 204型）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电热恒温水浴锅（DK–98-Ⅱ型）：天津市泰斯特仪器有限公司；真空干燥箱（DF-6020）：杭州蓝天化验仪器厂；超声仪（KQ 5200E型）：昆山市超声仪器有限公司。

1.1.2 试剂

芹菜购买于贵阳市煤矿村蔬菜市场，经天然药物质量控制研究中心陈华国老师鉴定；芦丁对照品：贵州迪大；其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮的提取与测定

芹菜清洗去杂后，晾干粉碎，精密称取芹菜粗粉2.00 g，置250 mL锥形瓶中，加入一定量，一定浓度的乙醇溶液，在一定温度下以一定的方式提取，冷却，过滤，滤液于50℃水浴中蒸发浓缩至呈黏稠膏状，移至真空干燥箱内50℃干燥2 h，取出，冷却至室温，称重，得浸膏质量。

浸膏用甲醇溶解，于25 mL容量瓶中定容，室温下超声处理5 min，使之尽可能溶解。之后移取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，加入甲醇至12 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，置5 min；加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，置5 min；加入4%NaOH溶液10 mL，定容至刻度，摇匀置15 min，于510 nm波长测定。

1.2.2 标准曲线的绘制

精密称取120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品20 mg于100 mL容量瓶中，甲醇定容，得0.2 mg/mL的标准储备液。

分别量取 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 标准储备液于25 mL容量瓶中，加入甲醇至12 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL置5 min，加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，置5 min，加入4%NaOH溶液10 mL，定容至刻度，摇匀置15 min，标准系列浓度依次为0.008、0.016、0.024、0.032、0.040 mg/mL。同法做试剂空白。

以空白溶液作参比，于510 nm波长测定吸光度，以吸光度对浓度进行线性回归，绘制标准曲线。得回归方程y=19.738x-0.005 7，R2=0.999 2，表明吸光度与芦丁浓度呈良好的线性关系。

1.2.3 方法学考察

分别研究不同溶剂浓度、提取温度、提取时间、提取方式、料液比对芹菜总黄酮提取率的影响。

1.2.4 总黄酮提取工艺参数的优化

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验表进行正交试验，优化芹菜中总黄酮提取的工艺条件。

2 结果与分析

2.1 溶剂浓度考察

精密称取2.000g芹菜粉末5份，分别用20%、40%、60%、80%、100% 的乙醇溶液以 1∶50（g：mL）的料液比加入锥形瓶中，混匀，85℃水浴加热回流提取总黄酮，试验结果见图1。

图1 乙醇浓度对提取工艺的影响Fig.1 Effects of ethanol concentrations on extracting process

由图1可见，乙醇浓度以40%为最佳，这可能是因为芹菜中黄酮为多种化合物的混合物，包括各种黄酮苷和苷元，这些物质由于极性和化学结构不同，在不同极性的提取溶剂中的溶解度也不尽相同。试验表明，体积分数为40%的乙醇溶液相对于其它浓度能更好地提取出芹菜中的黄酮类化合物。

2.2 提取方式考察

2.2.1 回流法

精密称取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇为溶剂，料液比 1∶50（g∶mL），85 ℃ 水浴回流提取总黄酮。

2.2.2 超声法

精密称取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇为溶剂，料液比 1∶50（g∶mL），功率 200 W，时间 25 min，60 ℃ 超声提取。

2.2.3 温浸法

精密称取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇为溶剂，料液比 1∶50（g∶mL），45 ℃ 恒温浸提总黄酮见图 2。

图2 不同提取方式对提取工艺的影响Fig.2 Effect of different extracting methods on extracting process

不同提取方式对芹菜中总黄酮的提取工艺也有影响，在回流、温浸、超声三种方式中，以回流效果较佳。这可能是由于部分黄酮类物质在超声过程中结构被破坏，从而导致超声效果较差，而温浸法则可能由于黄酮类物质在此过程中未被溶出，因此提取效果不佳。

2.3 提取温度考察

精密称取2.00 g芹菜粉末5份，以40%乙醇为溶剂，分别在 55、65、75、85、95℃ 条件下回流提取总黄酮，结果见图3。

图3 提取温度对提取工艺的影响Fig.3 Effects of extracting temperatures on extracting process

由图3表明：温度不同，提取的总黄酮的含量不同。在65℃和85℃时总黄酮的提取率相差无几，综合考虑温度太高可能使黄酮发生氧化，且杂质溶出较多，并增加能耗等因素，因此选最佳提取温度为65℃。

2.4 料液比考察

精密称取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇为溶剂，固液比分别为 1∶8（g∶mL），1∶10（g∶mL），1∶12（g∶mL），1∶15（g∶mL），1∶18（g∶mL），并于 65 ℃ 回流提取，结果如图4。

图4 料液比对提取工艺的影响Fig.4 Effects of solid liquid ratios on extracting process

从图4中可看出随着固液比的降低，提取的总黄酮含量随之增大，但当固液比达到 1∶15（g∶mL）后，黄酮的提取率增加不明显，考虑到提取剂用量和提取液蒸发浓缩时的能源消耗，固液比以1∶15（g∶mL）为宜。

2.5 提取时间考察

精密称取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇为溶剂，料液比为 1 ∶15（g∶mL），于 65 ℃回流提取，时间分别为0.5、1、2 、3 h，实验结果如图 5。

图5 提取时间对提取工艺的影响Fig.5 Effects of extracting time on extracting process

从图5可以看出，提取时间为1 h时提取效果比较理想，耗时短且提取率高，能较好的应用于实际生产中，因此考虑最佳提取时间为1 h。

2.6 总黄酮提取工艺参数的优化

为全面考察影响因素，基于单因素试验的结果，对影响提取效果的主要因素设计了三因素三水平的正交试验。试验因素水平见表1，正交试验结果见表2（其中D项为空白列），方差分析结果见表3。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal test

表2L9（34）正交试验结果Table 2Results for the orthogonal text L9（34）

表3 方差分析结果Table 3 Results of analysis of variance

由表2和表3可以看出，各因素对黄酮提取率均有显著性影响，依次为料液比＞回流时间＞提取次数，综合考虑，确定最佳工艺条件为A3B2C3。即以料液1 ∶18（g∶mL），每次 1 h，提取 3 次提取效果最佳。

2.7 优化工艺的验证

由于优选的工艺未包含在正交设计表的9次试验中，故对其进行了验证试验，结果见表4。

表4 优化工艺条件的验证结果Table 4 Results for the text of optimum process

用同一批药材，按条件A3B2C3进行三次重复试验，总黄酮含量稳定在3.5左右，RSD为0.19%，表明此优化工艺稳定、可行。

正交试验中部分试验测定的总黄酮的含量高于验证试验结果，但是差异不大，考虑到实际生产中时间宝贵、节约成本的问题，还是以正交试验优选的工艺条件为准。

3 讨论

3.1 加标回收率试验

为检验测定方法的准确性，对样品进行加标回收率试验，准确移取“1.2.1”项下的上清液1.0 mL 9份，分别加入浓度为0.0078 mg/mL标准溶液0.5、2.0、2.5 mL各3份，定容显色测定吸光度，结果表明，加入3种不同含量的标准溶液，样品加标回收率均在97%以上，回收率RSD为1.5%，说明试验方法是可行的。

3.2 精密度试验

按试验方法对浓度为0.060 mg/mL的芦丁标准溶液进行6次测定，相对标准偏差（RSD）为1.7%，表明仪器精密度良好。

表5 样品加标回收率测定结果Table 5 Results for the text of recovery

3.3 重复性试验

称取同一批次芹菜粉末，按“1.2.1”项下方法制备4份，并进行含量测定，计算芹菜中总黄酮含量。结果R.S.D.为2.07%，表明方法重现性良好。

4 结论

黄酮类化合物的提取，文献报道大多为溶剂萃取法、超声法、微波法、碱提酸沉法、碳吸附法提取、超临界CO2流体萃取法，结合黄酮类物质为亲水性有机溶剂，本实验以乙醇为溶剂考察了超声法、温浸法、热回流法等提取方式，同时对乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间做了单因素考察，又设计正交试验综合考察了料液比、提取时间和提取次数，又做了验证性试验、加标回收率试验，考察了精密度、重现性，从而确定芹菜中总黄酮的最佳提取工艺：乙醇浓度为40%，温度为 65℃，料液比为 1∶18（g∶mL），热回流提取 3次，每次1 h。

这一最佳提取工艺的获得对提高芹菜中总黄酮的提取率具有一定的参考价值，为芹菜的综合开发利用提供了科学依据。

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