微波辅助超声提取南瓜多糖及其抗氧化性研究

丁宏伟，李志香，蔡云飞

（齐鲁师范学院生物系，山东济南 250013）

南瓜是葫芦科植物南瓜的果实，具有生长强健，对环境适应性强、产量大、抗病虫害能力强、营养全面等特点，一般不需使用农药，少有污染，因此在我国南北方广为种植。南瓜的果肉富含多种氨基酸、维生素、多糖、果胶、矿物质，还含有类胡萝卜素等多种生物活性物质。南瓜多糖是其活性成分中最重要、最具潜力功能因子之一[2]，并对糖尿病症状有显著的治疗效果[3]。因此，对南瓜进行深加工，提取其南瓜多糖有着重要的经济效益。

目前，南瓜多糖常用的提取方法一般为热水浸提法，但此方法效率低，操作时间长。很多学者致力于寻找高效、快速、简易的南瓜多糖提取方法。本研究采用微波辅助超声波提取南瓜多糖，在单因素试验基础上，运用正交试验研究了微波处理时间、超声波处理时间及超声处理温度对多糖提取率的影响，优化了提取工艺，同时研究了提取的多糖的抗氧化性质，为今后南瓜的加工工艺及抗氧化活性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

市售洁净、成熟南瓜；苯酚，葡萄糖，硫酸，无水乙醇，水杨酸，浓盐酸，过氧化氢，蒽酮，七水硫酸亚铁，邻苯三酚，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼等，化学试剂均为分析纯；722s型分光光光度计：上海精密科学仪器有限公司；752pc紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；101－3－s电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；DS－1高速组织捣碎机：上海精密仪器仪表有限公司；CR20BZ型高速离心机：日立公司；81－2型恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司；超声波清洗仪KQ100DB（超声频率40 kHz，超声功率100 W）：上海越众仪器设备有限公司；格兰仕微波炉G80F20CSLB8（S0）（微波频率 2450 MHz，功率 800 W）：格兰仕；电子恒温水浴锅：国华电器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 南瓜多糖的热水浸提法[4]

将南瓜洗净切块，打浆，称取100 g，按料液比1∶4（g/mL）加入蒸馏水，置于 75℃～85℃水浴中 6 h，过滤收集滤液，虑渣再次加入1倍南瓜的水，相同温度提取6 h，过滤收集滤液，将两次所得抽提液混合浓缩。浓缩液经脱脂、脱蛋白和脱色后，于离心机中以4 000 r/min离心20 min，去除沉淀，将上清液与95%乙醇作用，静置2 h，于4 000 r/min离心20 min，将沉淀相继用丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，即得多糖样品，测定其多糖含量。

1.2.2 南瓜多糖含量测定[5]

总糖含量采用蒽酮－硫酸法测定；还原糖含量采用3，5－二硝基水杨酸比色法（以葡萄糖为标准品）。多糖含量＝总糖－还原糖含量。多糖提取率＝c×100%/m。式中：c为多糖含量；m为提取所用南瓜的质量。

1.2.3 南瓜多糖抗氧化性测定

1.2.3.1 清除羟基自由基（·OH）能力的测定[6]

反应体系中加入2 mL浓度为9 mmol/L的硫酸亚铁，2mL浓度为9mmol/L的水杨酸－乙醇混合液和不同浓度的样品3mL，2mL浓度为8.8mmol/L的过氧化氢，不同浓度的多糖样品3mL，启动反应，37℃反应1h，以蒸馏水为参比，在波长510 nm下测量各试样的吸光度，以2 mL的9 mmol/L硫酸亚铁，2 mL的9 mmol/L水杨酸－乙醇和2 mL蒸馏水为待测溶液的本底吸光度。

羟基自由基清除率＝[A0－（Ax-Ax0）/A0]×100%

式中：A0为对照，不加南瓜多糖，Ax为某浓度时的吸光值，Ax0为无显色剂时的该浓度的本底值。

1.2.3.2 清除超氧阴离子自由基（O2－·）能力的测定[7]

取 0.05 mol/L pH 8.2的 Tris－HCl缓冲液 4.5 mL，置于25℃水浴中预热，分别加入0.1 mL不同浓度的南瓜多糖样品液和0.4 mL浓度为25 mmol/L的邻苯三酚溶液，反应4 min，加入浓度8 mol/L浓盐酸终止反应，在波长290 nm下测定吸光度（Ai），空白组以同等体积的蒸馏水代替样品液，吸光度A0。

超氧阴离子自由基清除率＝[（Ai－A0）/A0]×100%。

1.2.3.3 DPPH自由基清除作用的测定[8]

取不同浓度的糖溶液1.5 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液3 mL，混匀后25℃静置20 min后在517 nm处测吸光度值。以蒸馏水代替样品作为空白，以酒精溶液代替DPPH－乙醇溶液作为对照。

DPPH自由基清除率＝[1－（Asample－Acontrol）/Ablank]×100%

1.2.4 试验设计

取料液比为1∶4（g/mL）的南瓜浆液，经微波炉处理 1、2、3、4、5 min 后，过滤收集滤液，虑渣再次加入 1倍南瓜的水，75℃～85℃水浴中提取2 h，按上述步骤处理后测定多糖含量，确定微波处理时间对多糖提取率的影响；将1∶4（g/mL）的南瓜浆液置于超声波清洗仪中（室温）处理 5、10、15、20、25、30 min，过滤收集滤液，按上述步骤处理后测定多糖含量，确定超声处理时间对多糖提取率的影响；分别将1∶4（g/mL）的南瓜浆液经 30、40、50、60、70、80 ℃的超声波处理 5 min，过滤收集滤液，按上述步骤处理后测定多糖含量，确定超声处理温度对多糖提取率的影响。

根据单因素试验结果，对微波处理时间、超声波处理时间及温度3个因素分别选择3个水平，进行正交试验，确定最佳的处理条件。将最佳处理条件下提取的南瓜多糖配制成 1、2、3、4、5 mg/mL浓度，测定其抗氧化性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波处理时间对南瓜多糖提取率的影响

实验前测得传统热水浸提法（料液比1∶4，提取温度75℃～85℃，提取时间12 h）对南瓜多糖的提取率为2.02%，将南瓜浆液经微波炉分别处理1、2、3、4、5 min后，过滤收集滤液，滤渣再次加入1倍南瓜的水，75℃～85℃水浴中提取2 h，处理后测定多糖含量，结果见图1。

从图1可以看出，由于微波处理后热水浸提时间比传统法短，因此在微波处理1 min～2 min时，多糖的得率较传统长时间热水浸提法的得率少，当超声时间2 min以上时，微波结合短时间热水浸提法的效果较传统浸提法明显提高，在微波处理时间3 min～4 min时，多糖得率变化缓慢，当微波处理时间超过4 min，多糖得率开始缓慢下降，可能是由于微波处理对南瓜多糖起到了破坏作用。因此，微波处理时间以不超过4 min为好。

图1 微波处理时间与多糖得率的关系Fig.1 Relation between microwave treatment time and extraction rate of pumpkin polysaccharide

2.1.2 超声波处理时间对南瓜多糖提取率的影响

将1∶4（g/mL）的南瓜浆液置于超声波清洗仪中（室温）处理 5、10、15、20、25、30 min，过滤收集滤液，处理后测定多糖含量，结果见图2。

图2 超声处理时间与多糖得率的关系Fig.2 Relation bebtween ultrasonic wave treatment time and extraction rate of pumpkin polysaccharide

从图2可以看出，随着超声处理时间的延长，南瓜多糖得率增大。在超声处理25 min以下时，南瓜多糖得率增加迅速，当超声处理25 min时，多糖得率达到2.83%，比传统热浸法提高41%，效果明显，当超声处理超过25 min时，多糖得率变化缓慢，因此，超声处理以不超过30 min为宜。

2.1.3 超声处理时的温度对南瓜多糖提取率的影响

分别将 1 ∶4（g/mL）的南瓜浆液经 30、40、50、60、70、80℃的超声波处理5 min，过滤收集滤液，处理后测定多糖含量，结果见图3。

图2 超声处理温度与多糖得率的关系Fig.2 Relation bebtween ultrasonic wave treatment temperature and extraction rate of pumpkin polysaccharide

从图3可以看出，南瓜多糖提取率随着超声处理温度的提高而增大，在70℃以下，随着温度的升高，多糖得率显著提高，温度高于70℃时，超声处理温度对多糖得率影响很小，而温度过高一方面能耗大，另一方面可能导致多糖降解，因此，超声处理温度以不超过80℃为宜。

2.2 正交试验分析

为了研究各因素的重要程度，确定3个因素同时作用时对试验结果有无协同作用，确定出最大的南瓜多糖提取率，分别对微波处理时间、超声处理时间及温度取合理的3个水平，以多糖得率为指标，按正交试验表L9（34）进行正交试验。确定最佳的处理条件组合。

2.2.1 因素水平表

因素水平表，见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor horizontal table

2.2.2 正交试验结果分析

正交试验结果分析，见表2。

由极差分析表可见，在这3个试验因素中，超声处理时间是最主要的影响因素，南瓜多糖提取率随超声处理时间延长而增大；其次是微波处理时间在3 min时最好，高于或低于该时间效果都较差；最后为超声处理温度，温度越高，提取率越高。最优的处理条件为A3B2C3，即超声处理30 min，微波处理3 min，超声处理温度70℃时南瓜多糖的提取率最大。

由方差分析表3可知，本试验的三个因素中，超声处理时间对南瓜提取率的影响最大，其次是微波处理时间，超声温度的影响最小。由于最优组合并未出现在正交表中，因此，对最优组合A3B2C3进行3次验证试验，测定南瓜多糖的提取率，计算平均值，此时提取率可达3.65%，比传统热浸提法效率提高了80%。

表2 正交试验结果及极差分析表Table 2 Experiment results and range analysis

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

2.3 南瓜多糖的抗氧化作用

羟基自由基被认为是毒性最强的活性氧自由基，比高锰酸钾和重铬酸钾氧化性还强，对机体的破坏作用最大[9]。超氧阴离子自由基（O2·）在氧化反应中扮演着非常重要的角色，因为在反应顺序上其他许多活性中间产物的形成都始于与O2·的作用。DPPH自由基是一种比较稳定的自由基，与其他自由基评价抗氧化性的方法比较，DPPH自由基能快速的反应样品的抗氧化活性[10]。抗坏血酸具有强的还原性，在食品中被广泛作为抗氧化剂使用，能够显著地清除羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基，因此，本实验选择抗坏血酸作为阳性对照。不同浓度南瓜多糖清除自由基的能力见表4。

由表4可见，不同浓度南瓜多糖，均对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基具有一定的清除作用。但效果均低于抗坏血酸。在南瓜多糖浓度为4 mg/mL以下时，南瓜多糖对各种自由的清除作用相对较弱，当浓度大于4 mg/mL时，对各种自由的清除作用明显提高，并且随着南瓜多糖浓度的提高，清除自由基的效果越明显。

表4 不同浓度南瓜多糖对自由基的清除作用Table 4 The scavenging effect of different density of pumpkin polysaccharide on free radical

3 结果与讨论

研究发现我国广为种植的南瓜不但营养丰富，而且具有保健和防病治病的功效，其中的南瓜多糖是其活性成分中最重要的功能因子，因此，对南瓜多糖的提取及其抗氧化性的研究有着重要的经济效益。超声及微波处理可将南瓜细胞壁粉碎，有利于多糖的溶出，南瓜多糖的溶出速度与超声处理时间、微波处理时间及超声处理温度有关。随着超声处理时间和微波处理时间的增加，多糖提取率增大。提高超声处理温度可以提高南瓜多糖的溶出速度，但效果不明显。

采用微波辅助超声波处理可以很大程度的提高南瓜多糖的提取率。其中，超声处理时间对多糖提取率的影响最为显著，其次是微波处理时间，超声处理温度有一定程度的影响。通过正交试验确定出最佳的处理方法，即微波时间3 min，超声处理时间30 min，超声温度70℃时效果最好，南瓜多糖的提取率为3.65%，与传统长时间热水浸提法相比，提高效率80%，同时提取时间可以大大缩短。将最佳处理条件下提取的南瓜多糖进行抗氧化性研究，结果表明，不同浓度的南瓜多糖对自由基均有清除作用，但比抗坏血酸的抗氧化性低。在低浓度时，南瓜多糖清除自由基的作用相对较小，当多糖浓度大于4 mg/mL时，对自由基的清除作用十分显著。

微波辅助超声处理可以粉碎南瓜细胞壁，从而释放细胞内物质，但是南瓜多糖的溶解过程比较复杂，微波及超声波对细胞壁的作用机理还不是十分清除。例如南瓜多糖如何溶出，释放的南瓜多糖的性质是否发生了变化等还有待于进一步的研究和讨论。采用本文所提供的方法提取南瓜多糖收率高，且能较好的保持其生理活性。对于提取的南瓜多糖的抗氧化性研究还可以在本研究的基础上进一步增加体内试验，从而进一步了解南瓜多糖的生理活性。

该研究为南瓜多糖的大规模的工业生产提供科学参考。当然目前的微波和超声设备由于其自身设计的局限性，不适宜在工业中的大规模应用，在实际应用时需要对设备进行改造，从而实现工业化生产。当然，如何实现工业化生产还存在很多问题，有待于进一步的研究和讨论。

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