杜仲叶多酚体内和体外抗氧化活性

刘迪，尚华，宋晓宇

（1.陕西工业职业技术学院化工与纺织学院，陕西咸阳 721000；2.陕西海升果业发展股份有限公司乾县分公司，陕西乾县 713300）

杜仲叶多酚体内和体外抗氧化活性

刘迪1，尚华1，宋晓宇2

（1.陕西工业职业技术学院化工与纺织学院，陕西咸阳 721000；2.陕西海升果业发展股份有限公司乾县分公司，陕西乾县 713300）

摘 要：为了评价杜仲叶多酚体内和体外抗氧化活性，杜仲叶经大孔吸附树脂分离、有机溶剂萃取后，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物两种多酚纯化产物，测定各产物中多酚质量分数，并采用动物试验考察各纯化产物对小鼠丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的影响，以评价不同多酚产物的体内抗氧化活性，同时测定各产物清除羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）及1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）的作用，以评价不同多酚产物的体外抗氧化活性。结果表明：正丁醇萃取物中多酚质量分数高于乙酸乙酯萃取物；正丁醇萃取物具有更为显著的体内和体外抗氧化活性。

关键词：杜仲叶；多酚；体内；体外；抗氧化

杜仲（Eucommia ulmoides）在我国有着悠久的药用历史，其具有降血压[1-3]、调节血糖[4-5]、保护肝脏[6]、强筋骨[7]等功效。杜仲作为中药材的使用部位是杜仲皮，然而现代研究表明，杜仲叶与杜仲皮的成分含量相近，甚至某些成分含量较杜仲皮高。天然产物具有很多保健功效，许多研究证明，天然产物的保健功效与其抗氧化作用的联系非常紧密[8-14]。杜仲叶中含有较丰富的多酚成分[15]，可以表现出较明显的抗氧化活性。已有研究表明杜仲具有较强的清除自由基的能力[16]，但研究对象多为杜仲粗提物，且为其体外抗氧化活性研究，和体内抗氧化的研究。本研究采用大孔吸附树脂分离、有机溶剂萃取的方法制备杜仲叶多酚，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，测定各产物中多酚物质的质量分数，分别评价各产物的体内抗氧化活性和体外抗氧化活性，初步探寻杜仲叶多酚质量分数与各产物抗氧化活性的相关性，为杜仲叶保健机理的研究提供相关参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜仲叶：陕西略阳杜仲人工繁育基地提供；XDA-8型大孔吸附树脂：西安蓝晓科技有限公司；没食子酸标准品：中国药品生物制品检定所；福林酚试剂（Folin-Ciocalteu）、1，1-二苯基-苦基苯肼（DPPH）：美国Sigma公司；抗坏血酸：天津市大茂化学试剂厂；邻二氮菲：天津市科密欧化学试剂有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

FW-400A粉碎机：北京科伟仪器有限公司；DK-98-1电热恒温水浴锅：天津泰斯特仪器有限公司；721可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HL-2恒流泵：上海亚荣有限公司。

1.3 试验动物

清洁级雄性昆明种小鼠：体重（20±2）g，由西安交通大学医学实验动物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 杜仲叶多酚的制备

采用XDA-8型大孔吸附树脂对杜仲叶粗提物进行分离。树脂经过预处理后按照规定的方法装柱，将1 BV体积的杜仲叶粗提液以1 BV/h的流速流过树脂柱，然后用4 BV左右的20%乙醇溶液以1 BV/h的流速进行洗脱，洗脱液减压浓缩至干，真空冷冻干燥成粉。将树脂分离产物配置成浓度为200 mg/mL的水溶液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次所用溶剂与水溶液的体积比为1∶2，合并各有机相萃取液。收集乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，减压浓缩至干，真空冷冻干燥成粉。

1.4.2 多酚质量分数测定

以没食子酸为标准品，用Folin-Ciocalteu[17]法对乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物进行检测，计算多酚在各干燥后的固体样品中的质量分数。

1.4.3 动物试验方法

小鼠被随机分为对照组、A组和B组，每组40只，分笼饲养。小鼠在SPF动物房中饲养，温度为（23±1）℃，相对湿度为40%～60%。小鼠先在SPF动物房适应3 d。用纯水将乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物溶解成0.2 g/mL的水溶液。每组小鼠被灌胃饲养。对照组灌胃纯水，A组灌胃乙酸乙酯萃取物，B灌胃正丁醇萃取物。每组每天用灌胃针灌胃1次，按每10 g体重0.1 mL连续灌胃15 d。各组动物在灌胃饲养期间自由饮水和进食。

1.4.4 体内抗氧化活性

末次灌胃1h后，分别从对照组、A组和B组取10只小鼠，将小鼠置于水深 30 cm、水温（25.0±1.0）℃的水箱中游泳90 min，然后立即取出，摘眼球取血，将血液在4 000 r/min下离心10 min后取血清，用分光光度法按照丙二醛（MDA）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明检测MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力。

1.4.5 体外抗氧化活性

将乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和VC分别配成0.1 mg/mL的水溶液，测定其对各自由基的清除能力。羟自由基（HO·）清除能力按照文献[18]所述方法测定；超氧阴离子（O2-·）清除能力按照文献[19]所述方法测定；1，1-二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）清除能力按照文献[20]所述方法测定。

1.4.6 统计分析方法

试验数据用均数±标准差（mean±S.E.M.）表示，t-检验法检验，p＜0.05被视为显著性差异，p＜0.01被视为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 多酚质量分数

经测定，乙酸乙酯萃取物多酚含量为30.45%，正丁醇萃取物多酚含量为61.12%。

2.2 体内抗氧化活性

2.2.1 MDA含量

不同产物对小鼠MDA含量的影响，结果如图1所示。与对照组相比较，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物均可以显著减少MDA含量（p＜0.05）。

图1 不同产物对小鼠MDA含量的影响Fig.1 Effect of products on the SOD activity in mice

MDA是脂质过氧化反应的产物。脂质过氧化反应过程会产生大量的自由基，对机体造成损伤，机体工作能力下降，甚至引发各种疾病。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物可以显著地降低MDA含量，表明二者可以降低脂质自由基对机体的危害。

2.2.2 SOD活性

不同产物对小鼠SOD活性的影响，结果如图2所示。

2 不同产物对小鼠SOD活性的影响Fig.2 Effect of products on the content of MDA in mice

与对照组相比，SOD活性可以被正丁醇萃取物显著地增强（p＜0.01），但是SOD活性受乙酸乙酯萃取物的影响并不显著（p＞0.05）。

SOD可以将O2-·还原为H2O2和O2，GSH-Px可以进一步将有机过氧化物和H2O2还原为水和无毒物质，因此SOD可以保护机体免受自由基的损伤。正丁醇萃取物可以显著提高SOD活性，表明正丁醇萃取物可以通过提高SOD活性提高机体清除自由基的能力。

2.2.3 GSH-PX活性

不同产物对小鼠GSH-Px活性的影响，结果如图3所示。

图3 不同产物对小鼠GSH-Px活性的影响Fig.3 Effect of products on the GSH-Px activity in mice

正丁醇萃取物可以增强GSH-Px活性（p＜0.05），但是乙酸乙酯萃取物对GSH-Px活性的影响也不显著（p＞0.05）。

GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶，在机体内广泛存在。GSH-Px可以清除由活性氧和·OH诱发的脂质过氧化物，保护细胞膜结构和功能的完整性，进而有效防止机体损伤。

2.3 体外抗氧化活性

2.3.1·OH清除效果

不同产物和VC对·OH清除率结果如图4所示。

4 不同产物和VC对·OH清除率Fig.4 ·OH Scavenging Rate of products and VC

与乙酸乙酯萃取物相比，正丁醇萃取物对清除·OH的能力非常显著地高于乙酸乙酯萃取物（p＜0.01），VC对·OH的清除能力显著地低于乙酸乙酯萃取物（p＜0.05）；与正丁醇萃取物相比，VC对·OH的清除能力非常显著地低于正丁醇萃取物（p＜0.01）。由此可见，正丁醇萃取物具有更强的清除·OH能力，甚至其清除·OH的能力比VC还要高。

2.3.2 对O2-·清除效果

不同产物和VC对O2-·清除率，结果如图5所示。

图5 不同产物和VC对O2-·清除率Fig.5 O2-·scavenging rate of products and VC

与乙酸乙酯萃取物相比，正丁醇萃取物和VC对O2-·清除的能力非常显著地高于乙酸乙酯萃取物（p＜0.01）；与正丁醇萃取物相比，VC与其对O2-·清除的能力相当（p＞0.05）。由此可见，正丁醇萃取物具有更强的清除O2-·的效果更强，并且其清除O2-·的能力与VC相当。

2.3.3 对DPPH·清除效果

不同产物和VC对DPPH·清除率，结果如图6所示。

图6 不同产物和VC对DPPH·清除率Fig.6 DPPH·scavenging rate of products and VC

与乙酸乙酯萃取物相比，正丁醇萃取物和VC对DPPH·的清除能力与之相当（p＞0.05）；与正丁醇萃取物相比，VC对DPPH·的清除能力也与之相当（p＞0.05）。可见，乙酸乙酯萃取物与正丁醇萃取物均具有较高的清除DPPH·的能力，且二者的清除能力与VC相当。

3 结论

1）杜仲叶经过大孔吸附树脂分离、有机溶剂萃取后，得到乙酸乙酯相和正丁醇相两种多酚纯化产物，正丁醇萃取物中多酚质量分数高于乙酸乙酯萃取物。

2）正丁醇萃取物具有更为显著的体内和体外抗氧化活性，即多酚质量分数高的萃取物其抗氧化活性也较高。

3）本研究为杜仲叶多酚抗氧化特性的研究提供了一定的理论支持。

4）建议进一步分离纯化杜仲叶多酚，得到纯度更高的杜仲叶多酚产物，研究高纯度杜仲叶多酚产物的抗氧化活性，为杜仲叶多酚抗氧化特性理论研究提供更有力的证实。

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The Antioxidation Activity in Vivo and in Vitro of Poyphenols Separated from Eucommia ulmoides Leaves

LIU Di1， SHANG Hua1， SONG Xiao-yu2
（1.Department of Chemical Engineering and Textile， Shaanxi Polytechnic Institute， Xianyang 721000，Shaanxi， China；2.Shaanxi Haisheng Fresh Fruit Juice Co.， Ltd.， Qian County Branch， Qian County 713300，Shaanxi， China）

Abstract：In order to study the antioxidation activity invivoand invitroof polyphenols separated fromEucommia ulmoidesleaves，theEucommia ulmoidesleaves were separated by resin and organic solvent and then ethyl acetate extract and butyl alcohol extract were gotten.The polyphenols in the extracts were tested for content.The content of malondialchehyche （MDA），the activity of superoxide dismutase （SOD）and glutathione peroxidase （GSH-Px） were investigated in mice to evaluate the antioxidation activity invivo.The scavenging capacity of the extracts on HO·， O2-·and DPPH·were tested to evaluate the antioxidation activity invitro.The result showed that the content of polyphenols in butyl alcohol extract was higher than that in ethyl acetate extraction，and butyl alcohol extract showed more significant antioxidation activity in vivo and in vitro.

Key words：Eucommia ulmoidesleaves；polyphenols；invivo；invitro； antioxidation

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.09.002

陕西省教育厅专项科研计划项目[苹果渣中根皮苷的提取分离研究（12JK0600）]；陕西工业职业技术学院自选科研计划项目[多酚物质根皮苷的制备研究（ZK11-31）]

刘迪（1980—），女（汉），博士，研究方向：化学新材料的制备。

2012-08-18