枸杞多糖对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

王玉彩，张玉涛，王家君

(1齐河县人民医院，山东 齐河 251100;2山东大学附属齐鲁医院)

枸杞多糖(LBP)是枸杞子的主要功效成分。近年研究表明，其具有增加免疫力、抗氧化、抑制细胞凋亡的作用。2007年5月～2008年9月，我们观察了LBP对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级、雄性、健康SD大鼠60只，鼠龄4个月，体质量(257±25)g，由青岛市药检所动物中心提供，批号:DK120415。LBP由宁夏中药厂提供纯品。超氧化物歧化酶(SOD)放射免疫分析试剂盒由北京华清生化技术研究所提供。Fas、bcl-2兔抗鼠单克隆抗体及SABC免疫组织化学试剂盒均由博士德生物制剂公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 随机将大鼠分为对照组、模型组、LBP处理组，各组20只。大鼠心肌缺血再灌注模型［1～3］:实验组、LBP 处理组在 1.55 mol/L乌拉坦5 mg/g静脉麻醉下，仰位固定，标准Ⅱ导联心电图检测，连接气管插管待开胸后联接人工呼吸机(潮气量为 2.0 L/100 mg，频率 50次/min)。在胸骨左缘旁0.5 cm处纵行切开第3～5肋，剪开心包，暴露心脏，结扎冠状动脉前降支，同时将一根直径2 mm塑料管置于结扎线与冠状动脉之间，拉紧结扎线使塑料管压迫引起冠脉闭塞，造成急性心肌缺血(ST段弓背向上抬高0.2 mV以上)。缺血35 min后，抽去塑料管，进行再灌注120 min。两组于冠脉结扎和再灌注前1 min分别由左心腔缓慢注射等量的生理盐水或1 mg/kg LBP。模型组有4只、LBP处理组2只大鼠死亡。

1.2.2 血清SOD含量检测 再灌注结束后，立即从大鼠左心室取血0.5 mL，静置20 min，3000 r/min离心10 min，取血清，采用SOD放射免疫分析试剂盒直接测定SOD含量。

1.2.3 Fas、bcl-2蛋白的表达检测 采血后处死动物，取出心脏，生理盐水反复冲洗后，于多聚甲醛固定液中固定24 h。心肌组织经过固定后，常规冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、连续切片、贴片于涂有多聚赖氨酸的载玻片上备用。采用HE染色观察各组心肌细胞的损伤情况，采用免疫组织化学法观察心肌组织中 Fas、bcl-2蛋白的表达。采用 OLYMPUS、BX50获得显微图像。免疫组化染色结果利用美国Sample PCI图像分析系统进行定量分析。每张切片以组织间质空白处入射光的值为定标。

1.2.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件，计量资料以表示，比较采用q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌组织学变化 对照组HE染色示心肌细胞结构清晰，层次清楚，无细胞水肿;模型组HE染色可见细胞水肿，部分细胞结构不清，密度不均，有细胞簇聚现象;LBP处理组HE染色可见细胞水肿明显减轻。

2.2 各组Fas、bcl-2免疫组化染色及血清SOD含量比较 见表1、图1。

表1 Fas、bcl-2免疫组化染色及血清SOD含量测定结果()

表1 Fas、bcl-2免疫组化染色及血清SOD含量测定结果()

注:与对照组、模型组比较，*P ＜0.05;与模型组比较，#P ＜0.05

组别 n Fas bcl-2 SOD(ng/mL)对照组20 0.216 ±3.021 0.389 ±0.012 615.400 ±20.100模型组 16 0.504 ±2.587* 0.201 ±0.010* 904.200 ±32.150*LBP 处理组 18 0.387 ±2.605*#0.376 ±0.007# 757.600 ±27.200*#

图1 心肌Fas、bcl-2免疫组化染色(×100)

3 讨论

心肌缺血组织再灌注后可引发一系列复杂的反应，使组织细胞损伤继续存在，这种血液再灌注使缺血性损伤进一步加重的现象即为缺血再灌注损伤。这一过程涉及许多免疫组织病理生理过程，其中起主导作用的是自由基产物堆积、缺氧和微循环改变等，最终导致细胞的坏死和凋亡［4］。

在缺血再灌注条件下，氧自由基为主要诱导因子，有多条细胞信号转导通路参与介导心肌细胞的凋亡。SOD是人体中一种内生性清除氧自由基的主要酶系，其作用可以特异性地催化氧自由基发生歧化反应，清除对体内有毒性作用的自由基，使其产生和清除处于动态平衡之中。任何增强氧化作用和降低抗氧化作用的因素均可破坏这一平衡，导致一系列的病理生理异常［5］。研究表明，LBP可以增强红细胞携氧能力和变形能力，具有调节微循环的流态和微循环周围状态的作用，从而降低冠脉阻力，改善心肌缺氧;而且对氧自由基具有清除作用，可抑制脂质过氧化反应，抑制细胞凋亡，故具有保护心肌细胞的作用［6］。在本实验中，模型组血清SOD比对照组明显升高，说明心肌缺血后生成了大量的自由基，从而对心肌造成损伤;而LBP处理组给予LBP后，血清SOD含量比模型组明显下降。说明LBP可以抑制可抑制脂质过氧化反应，清除自由基。

细胞凋亡是细胞死亡的一种重要形式，即程序性细胞死亡。研究发现，凋亡的发生与许多基因的调控有关［7］。许多重要的信号分子和信号事件参与了凋亡过程，如bcl家族、Fas/Fas-L等。Fas又称Apo-1，现名为CD95分子，属肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族成员，是细胞表面的凋亡信号受体［8］。Fas具有诱导细胞凋亡的能力，它可以和Fas配基或Fas抗体相互作用而导致表达Fas的细胞发生凋亡。在细胞凋亡过程中，bcl-2家族成员也起着至关重要的作用，是细胞凋亡的抑制基因［9］。研究表明，其过度表达能够抑制许多因素引起的细胞凋亡。在本实验中，模型组大鼠心肌组织中Fas的表达明显高于对照组，bcl-2的表达明显低于对照组。这说明在心肌缺血再灌注过程中，心肌细胞发生了凋亡;而LBP处理组大鼠的心肌组织中Fas的表达明显低于模型组，bcl-2的表达明显高于模型组。说明LBP抑制了心肌细胞的凋亡。

本实验中HE染色显示，对照组心肌细胞结构清晰，层次清楚，无细胞水肿;模型组HE染色可见细胞水肿，部分细胞结构不清，密度不均，有细胞簇聚现象;LBP处理组HE染色可见细胞水肿明显减轻。这表明模型组的心肌组织损伤严重，而LBP处理组损伤减轻。

总之，LBP通过清除缺血再灌注后血清中的自由基，降低了血清中SOD的含量，促进了bcl-2在心肌细胞的表达，抑制了Fas蛋白的表达，从而抑制了心肌细胞的凋亡，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。

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［6］方建国，丁水平，田庚元.枸杞多糖药理作用与临床应用［J］.医药导报，2004，23(7):484-485.

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