TNF-α诱导的衰老血管内皮细胞中泛素、细胞周期的变化及意义

赵海梅，谭 翌，杨小端

(南昌大学第三附属医院，南昌 330008)

血管内皮细胞连续被覆全身血管内膜，其不仅仅是血液和组织的屏障，还具有其他多种功能，如减少血管通透性、抗血栓作用、调节血管平滑肌、抑制血管壁细胞的游走和增殖等多种功能。内皮细胞受到破坏、损伤，功能降低，引起许多心脑血管疾病发生、发展。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由单核巨噬细胞产生、释放的，具有强大功能的炎症细胞因子，它可调节血管内皮细胞功能、改变其基因表达谱［1］。TNF-α引起的血管内皮细胞损伤破坏在很多心脑血管疾病和血栓疾病的发病中具有重要意义。泛素—蛋白酶体是由泛素以及一系列相关的酶组成。对细胞内多种基本活动非常重要，如降解非必需蛋白质、控制体内蛋白质的降解过程。而当蛋白质裂解作用发生异常时，正常降解过程受到破坏从而产生疾病。2011年3月～2012年3月，我们观察了衰老血管内皮细胞泛素的表达及细胞周期的改变，并探讨了其与心血管疾病发生、发展的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 原代血管内皮细胞分离取自剖腹产婴儿术后的新鲜脐带。M199完全培养基(含20%胎牛血清、4 ng/mL VEGF，Gibco 公司，USA)，胰蛋白酶(Gibco公司，USA)。Trizol试剂(Gibco公司，USA)，PCR引物由北京奥科生物公司合成。流式细胞仪采用美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 血管内皮细胞的培养与分组 取新鲜脐带约15 cm，剪除两侧受损部分，PBS冲洗静脉淤血。向脐静脉内注入0.25%胰蛋白酶约10 mL。放入37℃ PBS液中消化10 min。吸出脐静脉内消化液，注入离心管中，同时加入新生胎牛血清终止消化。1000 r/min离心5 min，吸除上清液，加入M199完全培养基。取0.1 mL细胞悬液，调整细胞密度至5×105/mL，接种于25 cm2培养瓶中。置于5%CO2、37℃条件下培养。24 h换液，除去死亡细胞及红细胞。以后每隔2 d换液1次，并补充营养液。当血管内皮细胞在培养瓶中融合80%以上时，0.25%胰蛋白酶3 mL加入内皮细胞中消化分离。倒置显微镜下观察，细胞皱缩、分离时加入含有10%胎牛血清的培养液终止消化。吸管吹打，制成2×105/mL的细胞悬液，按上述培养条件继续培养传代。一般约4 d行细胞传代培养。选取培养瓶中细胞形态良好的第2代脐静脉血管内皮细胞分为空白对照组、实验组。实验组加入20 ng/mL TNF-α 24 h刺激细胞加速衰老，空白对照组不予处理。

1.2.2 泛素的检测 血管内皮细胞融合80%以上，收集空白对照组及实验组细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，溶解于20 μL DEPC处理过的三蒸水，备用。在基因库中查得人泛素 DNA序列，应用primer5.0设计引物。泛素上游引物为5'-TTCGTGAAGACCCTGACCG-3'，下游引物为5'-GGATCTTGGCCTTCACGTTCT-3'。内参照GAPDH上游引物为5'-CTCCATCATGAAGTGTGA CGTT-3'，下游引物为5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCAG-3'，PCR 引物由北京奥科生物公司合成。首次循环94℃变性5 min，94℃变性30 s，52℃ 退火45 s，72℃延伸60 s，共34个循环，最后72℃延伸10 min，2%琼脂糖凝胶中行凝胶电泳分析。

1.2.3 细胞周期检测 选取第2代细胞，待细胞融合80%以上，实验组加入20 ng/mL TNF-α继续培养24 h，用0.25% 胰蛋白酶消化分离细胞，1000 r/min离心5 min弃上清液，PBS冲洗2次，重悬于500 μL的PBS中，加入5 mL冷乙醇，4℃ 固定过夜。1000 r/min离心5 min，弃乙醇，用5 mL的 PBS+1%胎牛血清洗2次，加入100 μL的10×PI溶液(用 PBS 配制成 500 μL/mL PI，pH 7.0);加入 100 μL RnaseA(用双蒸水配制成 10 mg/mL，pH 7.5，煮沸15 min)，37℃ 孵育30 min;流式细胞术分析(激发光波长488 nm，发射光波长570 nm);每次获取15000个细胞，采用BD公司的sinmulSET软件进行测定及分析。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件，计量资料以表示，比较采用配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组泛素mRNA检测结果比较 泛素 mRNA的表达在空白对照组明显低于实验组(P＜0.05)。见图 1、2。

图1 两组泛素、β-actin RT-PCR凝胶电泳结果

图2 两组泛素mRNA表达水平比较

2.2 两组细胞周期的变化 空白对照组细胞生长旺盛，细胞增殖旺盛，处于S期的细胞明显多于实验组。实验组细胞生长减慢，细胞从G1期进入S期的的比例逐渐降低，从G2期进入M期的比例逐渐增加，细胞增殖指数降低。详见图3、表1。

3 讨论

图3 对照组及实验组细胞周期

表1 对照组及实验组细胞周期比较(%)

血管内皮系统除了作为血液和组织间代谢交换的屏障外，还可产生和分泌多种生物活性物质，对调节血压和体液平衡具有重要意义［2］。其结构完整和功能正常是多种心血管疾病发生的重要影响因素。衰老及炎症因子等导致内皮细胞完整性的破坏和内皮细胞功能不全，可引发各种疾病。动脉粥样硬化时TNF-α合成增多;而人类典型动脉粥样硬化斑块中TNF-α阳性率高达90%，且与粥样硬化的严重程度成正比。因此，血管内皮功能障碍被认为是早期动脉粥样硬化发病机制中的重要事件，同动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、心血管事件的危险因素有密切的关系［3］。

泛素—蛋白酶体是细胞内蛋白质降解主要途径之一，不但可以清除损伤蛋白，而且还参与细胞凋亡、炎症、转录调控、信号转导、细胞周期等生物过程［4］。泛素—蛋白酶体途径是细胞内ATP依赖的蛋白质选择性降解的主要途径，是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与细胞凋亡、MHCⅠ类抗原的递呈、细胞周期以及细胞内信号转导等多种生理过程，对维持细胞的稳态具有十分重要的意义［5］。与泛素相关的疾病可分为2种:一种是泛素体系酶突变导致的功能丧失或者是目标底物蛋白识别基序的改变，导致某种蛋白的不稳定;另一种是目标蛋白功能不正常或加速降解。泛素—蛋白酶体途径是细胞内环境稳定的关键调节因素，细胞的许多重要蛋白都在此通路的调控之下。

泛素—蛋白酶体通路对细胞内信号转导及细胞生长调控是一个很重要的调节因素，并与许多生理及病理过程密切相关。核因子-κB(NF-κB)被认为是在动脉粥样硬化发生、发展过程中介导炎症—增殖反应的一种重要的调节因子。在NF-κB的激活中，泛素—蛋白酶体起到重要作用。正常情况下，内皮细胞产生的一氧化氮(NO)能够抑制NF-κB的转录活性，从而拮抗动脉粥样硬化的启动，但是各种损伤性刺激增加了氧化应激，使NO的生物利用度减少。抑制泛素—蛋白酶体能够上调一氧化氮合酶的表达，促进NO的合成［6］。在复杂的分子网络调节系统中，泛素—蛋白酶体系统在调节细胞周期各个阶段及各阶段之间的转换中具有重要作用［7］。不稳定的动脉粥样硬化斑块中，氧化低密度脂蛋白的增加或半衰期延长的蛋白质聚集，可导致泛蛋白—蛋白酶体系统(UPS)功能损伤。因为短寿命的促凋亡蛋白p53、bax、p27在细胞内是通过UPS降解的，因此，泛素化通路缺陷时，细胞内上述蛋白质含量增多，可使细胞周期停滞并凋亡。而细胞周期状态反映了细胞的增殖能力。凋亡细胞增加，血管功能进一步受到损伤，结构遭到破坏。血管内皮细胞调亡可以引起一系列血管结构和功能的改变，最终导致动脉硬化的发生。

本研究结果显示，实验组衰老血管内皮细胞泛素表达增高，同时细胞周期停滞，细胞凋亡增加，内皮功能受损。说明泛素—蛋白酶体除了移除受损蛋白质作用外，还参与其他一系列生理病理过程，包括再生、凋亡等，而这些都是动脉粥样硬化的重要特征［8］。已有研究表明，在动物扩张性心肌病及缺血性心肌病中，泛素化蛋白质的表达明显升高［9］。而心脏蛋白酶体是一个复杂的、异构的、动态的细胞器。心脏在压力超负荷、缺血或衰老等时功能退化，均可引起心肌细胞内泛素—蛋白酶体发生变化，导致疾病的发生、发展［10］。因此，我们应进一步研究泛素—蛋白酶系统，改善其功能，减少疾病的发生、发展。

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